Cette technique est plus fiable et efficace et ne nécessite pas de pratique ou de formation approfondie par rapport aux techniques d’appareils Langendorff les plus couramment utilisées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle limite le temps ischémique puisque la perfusion initiale se produit in vivo. Lors de l’exécution de cette technique, il est essentiel d’éviter les bulles dans le collecteur et d’éviter les mouvements excessifs du cœur pendant la digestion, ceux-ci peuvent diminuer le rendement.
Sarah Sturgill, étudiante diplômée dans le laboratoire du Dr Mark Ziolo, fera la démonstration de cette technique. Commencez par nettoyer le collecteur à température contrôlée à l’aide d’un tampon de perfusion fraîchement préparé. Pour ce faire, vissez une aiguille de calibre 27 et éliminez les bulles à l’aide d’un connecteur de verrouillage luer.
Assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles. Pour isoler le cardiomyocytes, exposer le sternum de la souris entièrement anesthésiée et, latéralement à la ligne médiane, couper proximale à travers les côtes et à l’aisselle. Ensuite, coupez à travers le diaphragme, en assurant des coupures peu profondes pour éviter le cœur.
Serrez le sternum avec un hémostatique et repliez les côtes vers l’arrière pour exposer la cavité thoracique. Retirez doucement le péricarde du cœur avant de couper à travers la veine cave inférieure immédiatement distale au cœur. Injectez trois millilitres de tampon de nettoyage glacé dans le ventricule droit du cœur pendant une minute à l’aide d’une aiguille de calibre 27.
Ensuite, tenez le cœur à l’aide d’une pince à épiler. Éloignez-le du corps et exposez autant que possible l’aorte. Ensuite, serrez l’aorte ascendante à l’aide d’un hémostatique et excisez le cœur.
Transférez rapidement le cœur serré sur le couvercle d’une boîte de Petri en polypropylène contenant 10 millilitres de tampon de perfusion chaude. Placez le cœur serré dans la plate-forme de support et injectez 10 millilitres de tampon de perfusion à température contrôlée à 37 degrés Celsius dans le ventricule gauche pendant cinq minutes à l’aide d’une aiguille stabilisée de calibre 27 fixée au collecteur. Ensuite, transférez le cœur serré et la plate-forme de support dans une boîte de Petri avec environ cinq millilitres de tampon de digestion.
Échangez des seringues d’entrée contre une seringue de 50 millilitres contenant 25 millilitres de tampon de digestion. Débarrassez le collecteur de toute bulle et du tampon de perfusion restant avant l’injection. Replacez délicatement l’aiguille dans la même position d’aiguille dans l’apex ventriculaire gauche.
À l’aide d’une pompe à perfusion, injectez un tampon de digestion de 37 degrés Celsius dans le ventricule gauche pendant 15 minutes à l’aide d’une seringue de 50 millilitres. Contrôlez la température de la solution avec une chemise d’eau calibrée pour éjecter une solution à 37 degrés Celsius. Retirez les ventricules des oreillettes avant de les transférer dans un bécher de 10 millilitres.
Ajouter trois millilitres de tampon de digestion au bécher et couper les ventricules en gros morceaux à l’aide de ciseaux tranchants. Couvrez le bécher avec du papier d’aluminium et placez-le dans un bain-marie tremblant préchauffé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension les morceaux de tissu dans trois millilitres de tampon de digestion et triturer pendant environ quatre minutes ou jusqu’à ce qu’un mélange homogène soit obtenu.
Une fois cela fait, filtrez les cellules dans un tube en polypropylène de 50 millilitres à l’aide d’une crépine à cellules en nylon de 70 micromètres. Lavez la passoire à cellules en nylon avec trois millilitres de tampon de digestion. Remettez le filtrat dans un tube en polypropylène à fond rond de 14 millilitres et centrifugez-le.
Jeter le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans trois millilitres de tampon d’arrêt. À la suspension cellulaire, ajoutez 54 microlitres de chlorure de calcium de 100 millimolaires pour obtenir une concentration finale de chlorure de calcium de 1,8 millimolaire. Laissez les cellules vivantes se déposer pendant 10 minutes et retirez le surnageant contenant des cellules mortes.
Après avoir remis en suspension la pastille dans une solution de stockage, les cellules peuvent être utilisées pour des expériences fonctionnelles et des cultures. Les images au microscope à fond clair de cellules isolées ont montré que l’isolement des cardiomyocytes de souris produisait des cellules quiescentes en forme de bâtonnets sans blebs membranaires ni bords arrondis. Les cellules ont montré un rendement d’environ 80% et des taux de survie élevés déterminant le succès de la technique d’isolement.
Pour une isolation réussie, il est très important de retirer les bulles du collecteur et d’insérer l’aiguille dans le même trou dans le cœur. Une fois isolés, les cardiomyocytes peuvent être utilisés pour des expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires.
