이 기술은 가장 일반적으로 사용되는 Langendorff 장치 기술에 비해 더 안정적이고 효율적이며 광범위한 연습이나 교육이 필요하지 않습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 초기 관류가 발생하기 때문에 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 이 기술을 수행하는 동안 매니폴드의 기포를 피하고 소화 중 심장의 과도한 움직임을 피하는 것이 필수적이며, 이는 수율을 감소시킬 수 있습니다.
이 기술을 시연하는 것은 Mark Ziolo 박사 연구실의 대학원생 인 Sarah Sturgill이 될 것입니다. 새로 준비된 관류 버퍼를 사용하여 온도 제어 매니폴드를 청소하는 것으로 시작합니다. 이렇게 하려면 27게이지 바늘을 조이고 루어 잠금 커넥터를 사용하여 기포를 제거합니다.
기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 심근 세포를 분리하기 위해 완전히 마취 된 마우스의 흉골을 노출시키고 정중선의 측면으로 갈비뼈와 겨드랑이를 통해 근위부로 자릅니다. 그런 다음 다이어프램을 절단하여 심장을 피하기 위해 얕은 절단을 보장합니다.
지혈제로 흉골을 고정하고 갈비뼈를 뒤로 접어 흉강을 노출시킵니다. 심장 바로 원위부에 있는 하대정맥을 절단하기 전에 심장에서 심낭을 부드럽게 제거합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 1 분 동안 3 밀리리터의 얼음 차가운 클리어링 버퍼를 심장의 우심실에 주입합니다.
다음으로 핀셋을 사용하여 심장을 잡습니다. 몸에서 떼어내고 가능한 한 많은 대동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 지혈제를 사용하여 상행 대동맥을 고정하고 심장을 절제하십시오.
클램핑 된 심장을 10 밀리리터의 따뜻한 관류 완충액이 들어있는 폴리 프로필렌 페트리 접시의 뚜껑으로 빠르게 옮깁니다. 클램핑된 심장을 지지 플랫폼에 놓고 매니폴드에 부착된 안정화된 27게이지 바늘을 사용하여 섭씨 37도에서 온도 제어 관류 완충액 10ml를 5분에 걸쳐 좌심실에 주입합니다. 다음으로, 클램핑 된 심장과지지 플랫폼을 약 5 밀리리터의 소화 완충액이있는 페트리 접시로 옮깁니다.
입력 주사기를 25밀리리터의 소화 완충액이 들어 있는 50밀리리터 주사기로 교환합니다. 주입하기 전에 기포의 매니폴드와 나머지 관류 완충액을 제거합니다. 바늘을 좌심실 정점의 동일한 바늘 위치로 조심스럽게 교체하십시오.
관류 펌프의 도움으로 50 밀리리터 주사기를 사용하여 섭씨 37도 소화 완충액을 좌심실에 15 분 동안 주입합니다. 섭씨 37도 용액을 배출하도록 보정된 워터 재킷으로 용액의 온도를 제어합니다. 심방을 10 밀리리터 비커로 옮기기 전에 심방에서 심실을 제거하십시오.
비커에 3 밀리리터의 소화 완충액을 넣고 날카로운 가위를 사용하여 심실을 큰 덩어리로 자릅니다. 비커를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도로 예열된 진탕수조에 5분 동안 넣습니다. 상청액을 버린 후, 조직 덩어리를 3 밀리리터의 소화 완충액에 재현 탁하고 약 4 분 동안 또는 균질 한 혼합물이 달성 될 때까지 분쇄합니다.
완료되면 70마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 사용하여 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 셀을 여과합니다. 나일론 세포 여과기를 3밀리리터의 소화 완충액으로 세척합니다. 여과액을 14 밀리리터 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브로 되돌려 놓고 원심 분리합니다.
펠릿을 3밀리리터의 정지 완충액에 재현탁하기 전에 상청액을 버립니다. 세포 현탁액에 54 마이크로 리터의 100 밀리몰 염화칼슘 스톡을 첨가하여 최종 염화칼슘 농도를 1.8 밀리몰로 만듭니다. 살아있는 세포를 10분 동안 침전시키고 죽은 세포가 들어 있는 상청액을 제거합니다.
펠릿을 저장 용액에 재현탁시킨 후, 세포는 기능적 실험 및 배양에 사용될 수 있다. 분리된 세포의 명시야 현미경 이미지는 마우스 심근 세포의 분리가 막 블랩이나 둥근 모서리가 없는 막대 모양의 정지 세포를 생성한다는 것을 보여주었습니다. 세포는 약 80%의 수율과 높은 생존율을 보였으며 분리 기술의 성공을 결정했습니다.
성공적인 격리를 위해서는 매니폴드에서 기포를 제거하고 심장의 동일한 구멍에 바늘을 삽입하는 것이 가장 중요합니다. 일단 분리되면 심근 세포는 세포 및 분자 기능 실험에 사용할 수 있습니다.
