Diese Technik ist zuverlässiger und effizienter und erfordert im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten Langendorff-Gerätetechniken keine umfangreiche Übung oder Ausbildung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die ischämische Zeit begrenzt, da die anfängliche Perfusion in vivo stattfindet. Bei dieser Technik ist es wichtig, Blasen im Verteiler zu vermeiden und eine übermäßige Bewegung des Herzens während der Verdauung zu vermeiden, da diese die Ausbeute verringern können.
Diese Technik wird Sarah Sturgill, eine Doktorandin im Labor von Dr. Mark Ziolo, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Reinigung des temperaturgesteuerten Verteilers mit frisch vorbereitetem Perfusionspuffer. Schrauben Sie dazu eine 27-Gauge-Nadel ein und entfernen Sie die Blasen mit einem Luer-Lock-Anschluss.
Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zurückbleiben. Um den Kardiomyozyten zu isolieren, legen Sie das Brustbein der vollständig anästhesierten Maus frei und schneiden Sie seitlich zur Mittellinie proximal durch die Rippen und zur Achselhöhle. Schneiden Sie dann durch das Zwerchfell und achten Sie auf flache Schnitte, um das Herz zu vermeiden.
Klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat fest und falten Sie die Rippen nach hinten, um die Brusthöhle freizulegen. Entfernen Sie das Perikard vorsichtig aus dem Herzen, bevor Sie die untere Hohlvene unmittelbar distal des Herzens durchtrennen. Injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel über eine Minute drei Milliliter eiskalten Clearing-Puffer in den rechten Ventrikel des Herzens.
Als nächstes halten Sie das Herz mit einer Pinzette. Ziehen Sie es vom Körper weg und legen Sie so viel wie möglich von der Aorta frei. Klemmen Sie dann die aufsteigende Aorta mit einem Hämostat fest und schneiden Sie das Herz heraus.
Übertragen Sie das geklemmte Herz schnell auf den Deckel einer Polypropylen-Petrischale, die 10 Milliliter warmen Perfusionspuffer enthält. Legen Sie das festgeklemmte Herz in die Stützplattform und injizieren Sie 10 Milliliter temperaturgesteuerten Perfusionspuffer bei 37 Grad Celsius über fünf Minuten in den linken Ventrikel mit einer stabilisierten 27-Gauge-Nadel, die am Verteiler befestigt ist. Als nächstes überführen Sie das eingespannte Herz und die Stützplattform in eine Petrischale mit etwa fünf Millilitern Verdauungspuffer.
Tauschen Sie Eingangsspritzen gegen eine 50-Milliliter-Spritze aus, die 25 Milliliter Aufschlusspuffer enthält. Befreien Sie den Verteiler vor der Injektion von Blasen und dem verbleibenden Perfusionspuffer. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Nadelposition an der linksventrikulären Spitze ein.
Mit Hilfe einer Perfusionspumpe spritzen Sie mit einer 50-Milliliter-Spritze 15 Minuten lang 37 Grad Celsius Aufschlusspuffer in den linken Ventrikel. Kontrollieren Sie die Temperatur der Lösung mit einem Wassermantel, der so kalibriert ist, dass er eine Lösung von 37 Grad Celsius ausstößt. Entfernen Sie die Ventrikel aus den Vorhöfen, bevor Sie sie in ein 10-Milliliter-Becherglas geben.
Drei Milliliter Verdauungspuffer in das Becherglas geben und die Ventrikel mit einer scharfen Schere in große Stücke schneiden. Decken Sie das Becherglas mit Alufolie ab und legen Sie es fünf Minuten lang in ein auf 37 Grad Celsius vorgeheiztes Schüttelwasser. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Gewebebrocken in drei Millilitern Verdauungspuffer und trituieren Sie ihn etwa vier Minuten lang oder bis eine homogene Mischung erreicht ist.
Wenn Sie fertig sind, filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Waschen Sie das Nylonzellsieb mit drei Millilitern Aufschlusspuffer. Geben Sie das Filtrat in ein 14-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden zurück und zentrifugieren Sie es.
Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in drei Milliliter Stopppuffer resuspendieren. Fügen Sie der Zellsuspension 54 Mikroliter 100 millimolaren Calciumchlorid-Brühe hinzu, um die endgültige Calciumchloridkonzentration auf 1,8 Millimolar zu erhöhen. Lassen Sie die lebenden Zellen 10 Minuten ruhen und entfernen Sie den Überstand mit den toten Zellen.
Nach der Resuspendierung des Pellets in einer Speicherlösung können die Zellen für funktionelle Experimente und Kulturen verwendet werden. Hellfeldmikroskopische Aufnahmen von isolierten Zellen zeigten, dass die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten stäbchenförmige ruhende Zellen ohne Membranbläschen oder abgerundete Kanten erzeugte. Die Zellen zeigten eine Ausbeute von etwa 80% und hohe Überlebensraten, die den Erfolg der Isolationstechnik bestimmten.
Für eine erfolgreiche Isolierung ist es am wichtigsten, die Blasen aus dem Verteiler zu entfernen und die Nadel in dasselbe Loch im Herzen einzuführen. Einmal isoliert, können die Kardiomyozyten für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente verwendet werden.
