L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

Questo protocollo consente l'estrazione delle molecole di glicogeno epatico in modo da preservarne la struttura e limitare la quantità di piccole particelle di glicogeno perse. Con precedenti ricerche che mostrano che il diabete altera la struttura del glicogeno, questo metodo potrebbe fornire nello studio del diabete e delle varie malattie da accumulo di glicogeno. Per estrarre il glicogeno dal fegato, iniziare trasferendo un grammo di tessuto epatico congelato in una provetta da 15 millilitri contenente sei millilitri di tampone di isolamento del glicogeno.

Mantenendo il ghiaccio, omogeneizzare il tessuto epatico utilizzando un omogeneizzatore per tessuti. Al termine, trasferire mezzo o tre millilitri di sospensione cellulare in una nuova provetta, seguita da ebollizione per 10 minuti. Tenere l'altra metà della sospensione su ghiaccio per estrarre le proteine associate contenenti glicogeno che non sono denaturate.

Per la determinazione del contenuto di glicogeno, rimuovere un'aliquota di otto microlitri da ciascuna provetta e mantenere la provetta sul ghiaccio. Dopo aver centrifugato la sospensione rimanente a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, trasferire il surnatante in provette per ultracentrifugare a 3,6 volte 10 al quinto G e a quattro gradi Celsius per 90 minuti. Dopo aver scartato i surnatanti rimanenti, risospendere i pellet in 1,5 millilitri di tampone di isolamento del glicogeno.

Quindi, stratificare i campioni su 1,5 millilitri di soluzione di saccarosio al 30% in quattro provette da ultracentrifuga da un millilitro, seguita da centrifugazione come descritto in precedenza per due ore. Dopo aver scartato i surnatanti, risospendere i pellet in 200 microlitri di acqua deionizzata. Per far precipitare il glicogeno dalla sospensione cellulare, aggiungere 800 microlitri di etanolo assoluto alle sospensioni cellulari e mescolare bene.

Quindi, conservare le miscele a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora per consentire le precipitazioni. Una volta avvenuta la precipitazione, centrifugare i campioni a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet di glicogeno in 200 microlitri di acqua deionizzata per ripetere tre volte il processo di precipitazione dell'etanolo. Dalla sospensione cellulare finale, rimuovere un'aliquota di otto microlitri da ciascuna provetta per la determinazione del contenuto di glicogeno.

Quindi, congelare i surnatanti rimanenti in azoto liquido e congelare per una notte. Il giorno successivo, conservare i campioni di glicogeno essiccati nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Lo studio ha analizzato la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del campione di glicogeno essiccato estratto in diverse condizioni.

Non sono state riscontrate differenze significative nella resa grezza e nella resa di glicogeno tra i gruppi estratti con le varie condizioni. Al contrario, la purezza del glicogeno è stata significativamente influenzata dalle concentrazioni di saccarosio e dall'aggiunta di una fase di ebollizione. Il glicogeno con la massima purezza è stato estratto utilizzando la concentrazione di saccarosio al 30% e una fase di ebollizione di 10 minuti.

Il glicogeno è stato estratto dall'omogenato epatico con il 30% 50% o il 72,5% di saccarosio, bollito o non bollito, per valutare gli effetti delle varie condizioni sulla dimensione delle molecole nell'estratto finale. L'analisi della lunghezza della catena è stata eseguita su sei fegati sia bolliti che non bolliti, utilizzando concentrazioni di saccarosio del 30%, 50% e 72,5%. È stato calcolato il contenuto delle molecole di glicogeno o particelle beta con un raggio idrodinamico, RH, inferiore a 30 nanometri.

I campioni bolliti avevano valori medi di umidità relativa più bassi e un contenuto di particelle più elevato rispetto ai campioni non bolliti. Inoltre, concentrazioni più basse di saccarosio hanno portato a valori di RH più bassi e a un contenuto di particelle beta più elevato. L'introduzione di una fase di ebollizione ha anche portato a valori di RH max o massimi più bassi, mentre la concentrazione di saccarosio non ha avuto alcun effetto significativo.

Assicurarsi che il tessuto sia completamente omogeneizzato e che non rimangano pezzi di tessuto. Quindi, questa tecnica ci apre la strada per esplorare quali percorsi collegano le particelle beta più piccole per formare le particelle alfa più grandi.