Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion der Glykogenmoleküle der Leber auf eine Weise, die ihre Struktur bewahrt und die Menge der verlorenen kleinen Glykogenpartikel begrenzt. Da frühere Forschungen gezeigt haben, dass Diabetes die Glykogenstruktur verändert, könnte diese Methode bei der Untersuchung von Diabetes und den verschiedenen Glykogenspeicherkrankheiten hilfreich sein. Um Glykogen aus der Leber zu extrahieren, überträgt man zunächst ein Gramm gefrorenes Lebergewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das sechs Milliliter Glykogen-Isolationspuffer enthält.
Während Sie auf Eis bleiben, homogenisieren Sie das Lebergewebe mit einem Gewebehomogenisator. Wenn Sie fertig sind, geben Sie einen halben oder drei Milliliter der Zellsuspension in ein neues Röhrchen und kochen Sie sie anschließend 10 Minuten lang. Halten Sie die andere Hälfte der Suspension auf Eis, um glykogenhaltige assoziierte Proteine zu extrahieren, die nicht denaturiert sind.
Für die Bestimmung des Glykogengehalts wird aus jedem Röhrchen ein Aliquot von acht Mikrolitern entnommen und das Röhrchen auf Eis gelegt. Nachdem die verbleibende Suspension 10 Minuten lang bei 6.000 G bei vier Grad Celsius geschleudert wurde, wird der Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen überführt, um sie 90 Minuten lang bei 3,6 mal 10 bis zum fünften G und vier Grad Celsius zu zentrifugieren. Nachdem Sie die verbleibenden Überstände verworfen haben, resuspendieren Sie die Pellets in 1,5 Milliliter Glykogen-Isolationspuffer.
Dann schichten Sie die Proben über 1,5 Milliliter 30%ige Saccharoselösung in vier Milliliter Ultrazentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation wie zuvor beschrieben für zwei Stunden. Nachdem Sie die Überstände verworfen haben, werden die Pellets in 200 Mikroliter deionisiertem Wasser resuspendiert. Um Glykogen aus der Zellsuspension auszufällen, fügen Sie 800 Mikroliter absolutes Ethanol zu den Zellsuspensionen hinzu und mischen Sie sie gut.
Lagern Sie die Mischungen dann mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius, damit sie niederschlagen können. Sobald die Fällung erfolgt, zentrifugieren Sie die Proben bei 6.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Glykogenpellet in 200 Mikroliter deionisiertem Wasser, um den Ethanolfällungsprozess dreimal zu wiederholen. Aus der endgültigen Zellsuspension wird ein Aliquot von acht Mikrolitern aus jedem Röhrchen entnommen, um den Glykogengehalt zu bestimmen.
Anschließend die restlichen Überstände in flüssigem Stickstoff einfrieren und über Nacht gefriertrocknen. Lagern Sie die getrockneten Glykogenproben am nächsten Tag im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Die Studie analysierte die Reinheit, die Rohölausbeute und die Glykogenausbeute der getrockneten Glykogenprobe, die unter verschiedenen Bedingungen extrahiert wurde.
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Rohölausbeute und der Glykogenausbeute zwischen den Gruppen, die unter den verschiedenen Bedingungen extrahiert wurden. Im Gegensatz dazu wurde die Glykogenreinheit durch die Saccharosekonzentrationen und die Zugabe einer Siedestufe signifikant beeinflusst. Glykogen mit der höchsten Reinheit wurde unter Verwendung der 30%igen Saccharosekonzentration und eines 10-minütigen Siedeschritts extrahiert.
Glykogen wurde aus dem Leberhomogenat entweder mit 30 %, 50 % oder 72,5 % Saccharose, gekocht oder ungekocht, extrahiert, um die Auswirkungen der verschiedenen Bedingungen auf die Größe der Moleküle im endgültigen Extrakt zu bewerten. Die Kettenlängenanalyse wurde an sechs Lebern sowohl für gekochte als auch für ungekochte Lebern durchgeführt, wobei Konzentrationen von 30 %, 50 % und 72,5 % Saccharose verwendet wurden. Der Gehalt der Glykogenmoleküle oder Beta-Teilchen mit einem hydrodynamischen Radius (RH) von weniger als 30 Nanometern wurde berechnet.
Die gekochten Proben wiesen niedrigere durchschnittliche RH-Werte und einen höheren Partikelgehalt auf als die ungekochten Proben. Niedrigere Saccharosekonzentrationen führten auch zu niedrigeren RH-Werten und höheren Beta-Partikelgehalten. Die Einführung einer Siedestufe führte ebenfalls zu niedrigeren RH-max- bzw. Maxima-Werten, während die Saccharosekonzentration keinen signifikanten Einfluss hatte.
Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig homogenisiert ist und keine Gewebestücke zurückbleiben. Diese Technik ebnet uns also den Weg, um zu erforschen, welche Wege die kleineren Beta-Teilchen miteinander verbinden, um die größeren Alpha-Teilchen zu bilden.
