グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

このプロトコルは構造を維持し、失われる小さいグリコーゲンの粒子の量を限る方法でレバー グリコーゲンの分子の抽出を可能にする。糖尿病がグリコーゲン構造を変化させることを示す以前の研究により、この方法は糖尿病やさまざまなグリコーゲン貯蔵疾患の研究に役立つ可能性があります。肝臓からグリコーゲンを抽出するには、まず1グラムの凍結肝組織を、6ミリリットルのグリコーゲン分離バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。

氷上に保持しながら、組織ホモジナイザーを使用して肝臓組織を均質化します。完了したら、半ミリリットルまたは3ミリリットルの細胞懸濁液を新しいチューブに移し、続いて10分間沸騰させます。懸濁液の残りの半分を氷上に置いて、変性していないグリコーゲン含有関連タンパク質を抽出します。

グリコーゲン含有量を測定するには、各チューブから8マイクロリットルのアリコートを取り出し、チューブを氷上に保管します。残りの懸濁液を6, 000Gで4°Cで10分間紡糸した後、上清を超遠心チューブに移し、10倍3.6倍で5Gまで遠心分離し、摂氏4度で90分間遠心分離します。残りの上清を廃棄した後、ペレットを1.5ミリリットルのグリコーゲン単離バッファーに再懸濁します。

次に、サンプルを4ミリリットルの超遠心チューブに1.5ミリリットルの30%スクロース溶液で重ね、その後、前述のように2時間遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを200マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁します。細胞懸濁液からグリコーゲンを沈殿させるには、細胞懸濁液に800マイクロリットルの無水エタノールを加え、よく混合します。

次に、混合物を摂氏マイナス20度で少なくとも1時間保存して、沈殿させます。沈殿が起こったら、4つの摂氏温度で10分間6、000 Gでサンプルを遠心分離し、エタノール沈殿プロセスを3回繰り返すために脱イオン水の200マイクロリットルのグリコーゲンの餌を再懸濁する。最終細胞懸濁液から、グリコーゲン含有量を測定するために、各チューブから8マイクロリットルのアリコートを除去します。

次に、残りの上澄み液を液体窒素で凍結し、一晩凍結乾燥します。翌日、乾燥グリコーゲンサンプルをマイナス20°Cの冷凍庫で保管します。この研究では、さまざまな条件で抽出された乾燥グリコーゲンサンプルの純度、粗収率、およびグリコーゲン収量を分析しました。

種々の条件で抽出した群間で粗収量およびグリコーゲン収量に有意差は認められなかった。対照的に、グリコーゲン純度は、ショ糖濃度および沸騰工程の添加によって有意に影響された。最も純度の高いグリコーゲンを、30%のショ糖濃度と10分間の煮沸工程を用いて抽出した。

グリコーゲンは、30%50%または72.5%のスクロース(煮沸または未沸騰)によって肝臓ホモジネートから抽出され、最終抽出物中の分子のサイズに対するさまざまな条件の影響を評価しました。6つの肝臓について、30%、50%、72.5%のスクロース濃度を用いて、ゆで状態と未沸騰状態の両方で鎖長分析を行った。流体力学的半径RHを有するグリコーゲン分子またはベータ粒子の含有量を30ナノメートル未満で計算した。

煮沸したサンプルは、未沸騰のサンプルよりも平均RH値が低く、粒子含有量が高かった。また、ショ糖濃度が低いほど、RH値が低くなり、ベータ粒子の含有量が高くなります。煮沸ステップの導入は、RH maxまたは最大値の低下にもつながりましたが、スクロース濃度は有意な影響を及ぼさなかった。

組織が完全に均質化され、組織の塊が残っていないことを確認してください。したがって、この手法は、小さなベータ粒子をつなぎ合わせて大きなアルファ粒子を形成する経路を探る道を開きます。