Este protocolo permite la extracción de las moléculas de glucógeno hepático de una manera que preserva su estructura y limita la cantidad de pequeñas partículas de glucógeno perdidas. Con investigaciones anteriores que muestran que la diabetes altera la estructura del glucógeno, este método podría ayudar a estudiar la diabetes y las diversas enfermedades de almacenamiento de glucógeno. Para extraer glucógeno del hígado, comience transfiriendo un gramo de tejido hepático congelado a un tubo de 15 mililitros que contenga seis mililitros de tampón de aislamiento de glucógeno.
Mientras se mantiene en hielo, homogeneice el tejido hepático con un homogeneizador de tejidos. Cuando esté listo, transfiera la mitad o tres mililitros de la suspensión celular a un tubo nuevo, seguido de ebullición durante 10 minutos. Mantenga la otra mitad de la suspensión en hielo para extraer las proteínas asociadas que contienen glucógeno que no están desnaturalizadas.
Para la determinación del contenido de glucógeno, retire una alícuota de ocho microlitros de cada tubo y mantenga el tubo en hielo. Después de hacer girar la suspensión restante a 6.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga para centrifugarlos a 3,6 veces 10 a la quinta G y cuatro grados Celsius durante 90 minutos. Después de desechar los sobrenadantes restantes, vuelva a suspender los gránulos en 1,5 mililitros de tampón de aislamiento de glucógeno.
A continuación, coloque las muestras en capas sobre 1,5 mililitros de solución de sacarosa al 30% en tubos de ultracentrífuga de cuatro mililitros, seguido de una centrifugación como se ha descrito anteriormente durante dos horas. Después de desechar los sobrenadantes, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de agua desionizada. Para precipitar el glucógeno de la suspensión celular, agregue 800 microlitros de etanol absoluto a las suspensiones celulares y mezcle bien.
Luego, almacene las mezclas a menos 20 grados centígrados durante al menos una hora para permitir la precipitación. Una vez que se produce la precipitación, centrifugar las muestras a 6.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el gránulo de glucógeno en 200 microlitros de agua desionizada para repetir el proceso de precipitación de etanol tres veces. De la suspensión celular final, retire una alícuota de ocho microlitros de cada tubo para determinar el contenido de glucógeno.
Luego, congele los sobrenadantes restantes en nitrógeno líquido y liofilice durante la noche. Al día siguiente, guarde las muestras de glucógeno seco en el congelador a menos 20 grados centígrados. El estudio analizó la pureza, el rendimiento bruto y el rendimiento de glucógeno de la muestra de glucógeno seco extraída por diferentes condiciones.
No hubo diferencias significativas en el rendimiento bruto y el rendimiento de glucógeno entre los grupos extraídos con las distintas condiciones. Por el contrario, la pureza del glucógeno se vio significativamente influenciada por las concentraciones de sacarosa y la adición de un paso de ebullición. El glucógeno con la mayor pureza se extrajo utilizando la concentración de sacarosa al 30% y un paso de ebullición de 10 minutos.
El glucógeno se extrajo del homogeneizado del hígado con sacarosa al 30%, 50% o 72,5%, hervida o sin hervir, para evaluar los efectos de las diversas condiciones sobre el tamaño de las moléculas en el extracto final. El análisis de la longitud de la cadena se realizó en seis hígados tanto para hervidos como para no hervidos, utilizando concentraciones de sacarosa del 30%, 50% y 72,5%. Se calculó el contenido de las moléculas de glucógeno o partículas beta con un radio hidrodinámico, HR, inferior a 30 nanómetros.
Las muestras hervidas tenían valores promedio de HR más bajos y un mayor contenido de partículas que las muestras no hervidas. Además, las concentraciones más bajas de sacarosa dieron lugar a valores de HR más bajos y a un mayor contenido de partículas beta. La introducción de un paso de ebullición también condujo a valores más bajos de HR máx. o máximos, mientras que la concentración de sacarosa no tuvo un efecto significativo.
Asegúrese de que el tejido esté completamente homogeneizado y que no queden trozos de tejido. Por lo tanto, esta técnica allana el camino para que exploremos qué caminos unen las partículas beta más pequeñas para formar las partículas alfa más grandes.
