肝糖原分子的提取用于糖原结构测定

该协议允许以保留其结构并限制小糖原颗粒丢失量的方式提取肝糖原分子。先前的研究表明糖尿病会改变糖原结构，这种方法可以为糖尿病和各种糖原贮积病的研究提供参考。要从肝脏中提取糖原，首先将 1 克冷冻肝组织转移到含有 6 毫升糖原分离缓冲液的 15 毫升试管中。

在保持冰块的同时，使用组织均质器使肝组织均质化。完成后，将半升或三毫升细胞悬液转移到新试管中，然后煮沸 10 分钟。将悬浮液的另一半放在冰上，以提取未变性的含糖原相关蛋白质。

对于糖原含量测定，从每个试管中取出一个 8 微升等分试样，并将试管放在冰上。在4摄氏度下将剩余的悬浮液在6,000G下旋转10分钟后，将上清液转移到超速离心管中，以3.6乘以10至5G和4摄氏度离心90分钟。弃去剩余的上清液后，将沉淀重悬于1.5毫升糖原分离缓冲液中。

然后，将样品分层在4毫升超速离心管中的1.5毫升30%蔗糖溶液上，然后如前所述离心两小时。弃去上清液后，将沉淀重悬于200微升去离子水中。要从细胞悬液中沉淀糖原，请向细胞悬液中加入 800 微升无水乙醇并充分混合。

然后，将混合物储存在零下 20 摄氏度至少一小时以允许沉淀。一旦发生沉淀，将样品在6,000G下离心10分钟，在4摄氏度下，并将糖原沉淀重悬于200微升去离子水中，重复乙醇沉淀过程三次。从最终的细胞悬液中，从每个试管中取出 8 μL 的等分试样以测定糖原含量。

然后，将剩余的上清液冷冻在液氮中并冷冻干燥过夜。第二天，将干燥的糖原样品存放在零下20摄氏度的冰箱中。本研究分析了不同条件下提取的干燥糖原样品的纯度、粗品收率和糖原收率。

不同条件下提取的组间粗产量和糖原产量无显著差异。相反，糖原纯度受蔗糖浓度和加入煮沸步骤的显著影响。使用30%蔗糖浓度和10分钟的煮沸步骤提取纯度最高的糖原。

用30%50%或72.5%的蔗糖（煮沸或未煮沸）从肝脏匀浆中提取糖原，以评估各种条件对最终提取物中分子大小的影响。对6个肝脏进行链长分析，包括煮沸和未煮沸，分别使用30%50%和72.5%的蔗糖浓度。计算了流体动力学半径RH小于30纳米的糖原分子或β颗粒的含量。

与未煮沸的样品相比，煮沸样品的平均相对湿度值较低，颗粒含量较高。此外，较低的蔗糖浓度导致较低的相对湿度值和较高的β颗粒含量。煮沸步骤的引入也导致较低的RH max或最大值，而蔗糖浓度没有显着影响。

确保组织完全均质化，并且没有残留组织块。因此，这种技术为我们探索将较小的β粒子连接在一起以形成较大的α粒子的路径铺平了道路。