وصف بروتوكولنا استخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الفلورسنت أو المعبر عن الإنارة للكشف عن الفيروسات الحية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي وتتبع الفيروسات في نموذج الفأر المعدل وراثيا ACE2 البشري K18 لعدوى SARS-CoV-2. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تطبيق وجدوى الكشف عن الفيروسات وتتبعها في الجسم الحي والدراسات خارج الجسم الحي ل SARS-CoV-2 في نموذج الفأر المعدل وراثيا ACE2 البشري K18. يمثل استخدام التصوير الحي ل SARS-CoV-2 في نموذج الفأر المعدل وراثيا ACE2 البشري K18 خيارا ممتازا لتقييم العلاجات لعلاج عدوى SARS-CoV-2 في الجسم الحي.
يمثل تنفيذ المراسلين SARS-CoV-2 خيارا ممتازا لتقييم الإمراض والتكاثر الفيروسي والكأس في الجسم الحي. بالنسبة للدراسات في الجسم الحي مع لوسيفيراز الذي يعبر عن SARS-CoV-2 ، يوصى بحلاقة الفئران والتصوير الفوري بعد حقن الركيزة لتحسين إشارة التلألؤ الحيوي. ابدأ مراقبة التلألؤ الحيوي عن طريق بدء تشغيل نظام التصوير في الجسم الحي ، أو IVIS ، وإعداد المعلمات ، وانقر فوق وضع الصورة إلى التلألؤ الحيوي ثم افتح المرشح واضبط وقت التعرض على تلقائي.
بعد ذلك ، قم بإزالة فأر محلوق ومخدر بالفعل من غرفة العزل واستخدم إبرة قياس 25 لإدارة 100 ميكرولتر من ركيزة luciferase المخففة من 1 إلى 10 في PBS إلى الفأر. ثم ضع الماوس مرة أخرى في غرفة العزل ، ونقل غرفة العزل إلى جهاز IVIS ، المجهز بمكون تسخين لمنع انخفاض حرارة الجسم ، وإغلاق باب تصوير IVIS لتهيئة التصوير عن طريق تحديد Acquisition في البرنامج البرمجي. لتحليل صور التلألؤ الحيوي المكتسبة ، استخدم أداة عائد الاستثمار أو المنطقة ذات الأهمية في البرنامج لتعيين الإشارة الدقيقة وقياس التدفق.
بدء تشغيل برنامج التصوير وإعداد المعلمات. انقر فوق وضع الصورة إلى Fluorescence ، واضبط الإثارة على 500 نانومتر ومرشحات الانبعاثات على 530 نانومتر ، واضبط وقت التعرض على Auto. قم بإجراء تنظير النخر واستئصال الرئتين من الفئران.
ضع الرئتين المقطوعتين في صفيحة من 6 آبار تحتوي على ملليلترين من 1X PBS وشطفها لإزالة الدم الزائد. تطهير وتنظيف أدوات الجراحة بين العينات باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد تهيئة جهاز IVIS ، ضع الرئتين على ورقة سوداء وافصل الأنسجة عن بعضها البعض.
ثم ضع الدرج داخل غرفة العزل داخل خزانة السلامة البيولوجية ثم انقل غرفة العزل إلى IVIS. أغلق باب تصوير IVIS وانقر على Acquisition لبدء تشغيل نظام التصوير. لتحليل التألق ، استخدم أداة عائد الاستثمار وارسم عائد الاستثمار حول كل من الرئتين الفرديتين.
قم بقياس كل عائد استثمار يدويا ثم استخدم متوسط قيم كفاءة الإشعاع المعطاة واطرحها من الفئران المصابة الوهمية. بمجرد اكتمال التصوير ، ضع الأنسجة في أنبوب تبريد لتجميد الثلج الجاف لتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمعالجتها لاحقا. باستخدام supernate التي تم الحصول عليها من متجانسات الأنسجة ، وإجراء تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف وإصابة الطبقات الأحادية المتقاربة من خلايا Vero E6 مع ملليلتر واحد من كل تخفيف supernatant في ثلاثة أضعاف.
دع الفيروس يمتص لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اغسل الخلايا بملليلتر واحد من 1X PBS ثم احتضن الخلايا في ملليلترين من وسائط ما بعد العدوى التي تحتوي على 1٪ أجار في حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطبة بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة ، قم بتعطيل الألواح في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية ، مما يضمن غمر اللوحة بأكملها.
أخرج الألواح من مستوى السلامة البيولوجية الثالث واغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلتر واحد من 0.5٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بحظر الخلايا المتخلل بملليلتر واحد من 2.5 ألبومين مصل البقر أو BSA و PBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية تليها الحضانة في ملليلتر واحد من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من بروتين SARS-CoV النووي عبر الجسم المضاد أحادي النسيلة التفاعلي 1C7C7 المخفف في 2.5 BSA لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. اغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلتر واحد من 1X PBS وطور اللويحات باستخدام مجموعات ركيزة ABC و diaminobenzene ، أو DAB ، البيروكسيديز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم احسب العيار الفيروسي كوحدات لتشكيل البلاك لكل ملليلتر.
في الدراسة ، لوحظ أن نانولوسيفيراز المضيئة بيولوجيا ، أو Nluc ، تم اكتشافها بسهولة وأن الفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Nluc ، ولكن ليس تلك المصابة بالنوع البري rSARS-CoV-2 أو الوهمية المصابة. أظهرت التحليلات الكمية شدة Nluc في أيام مختلفة بعد الإصابة. كانت الآفات الإجمالية على سطح الرئة للفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Nluc مماثلة لتلك الموجودة في المجموعة المصابة من النوع البري rSARS-CoV-2.
بالإضافة إلى ذلك ، كانت العيار الفيروسي المكتشف والفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Nluc قابلة للمقارنة مع تلك المصابة بالنوع البري rSARS-CoV-2 في جميع الأعضاء في أيام مختلفة بعد الإصابة. في الوقت نفسه ، تم اكتشاف نشاط Nluc فقط في الأعضاء من الفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Nluc. تمت مراقبة مجموعة منفصلة من الفئران الوهمية المصابة والفيروسات لمدة 12 يوما للتغيرات في وزن الجسم والبقاء على قيد الحياة.
فقدت الفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Nluc و rSARS-CoV-2 من النوع البري ما يصل إلى 25٪ من وزن الجسم وتستسلم جميعها للعدوى الفيروسية بين سبعة إلى ثمانية أيام بعد الإصابة. بعد عدوى الزهرة rSARS-CoV-2 ، تم اكتشاف تعبير كوكب الزهرة بسهولة في جميع الرئتين من الفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Venus ولكن ليس تلك المصابة ب rSARS-CoV-2 من النوع البري أو المصاب الوهمي. وأظهرت التحليلات الكمية أن شدة كوكب الزهرة تبلغ ذروتها بعد يومين من الإصابة وتنخفض على مدار العدوى ورئتي الفئران المصابة.
كشفت صور سطح الرئة أن الآفات الإجمالية للفئران المصابة بفيروس rSARS-CoV-2 Venus كانت مماثلة لتلك التي كانت لدى الفئران المصابة من النوع البري rSARS-CoV-2. كما أدت العدوى بزهرة rSARS-CoV-2 إلى عيارات فيروسية مماثلة لتلك التي لوحظت في الفئران المصابة بالنوع البري rSARS-CoV-2 في جميع الأعضاء. فقدت الفئران المصابة ب rSARS-CoV-2 Venus و rSARS-CoV-2 من النوع البري ما يصل إلى 25٪ من وزن جسمها واستسلمت للعدوى الفيروسية بحلول اليوم التاسع بعد الإصابة دون البقاء على قيد الحياة.
أظهرت النتائج من المراسل الذي يعبر عن SARS-CoV-2 أنها بدائل صالحة للعدوى الفيروسية. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحديد وتقييم سريع للتدابير المضادة لعلاج عدوى SARS-CoV-2.
