הפרוטוקול שלנו תיאר את השימוש ב-SARS-CoV-2 רקומביננטי פלואורסצנטי או בעל ביטוי זוהר לזיהוי נגיפי הדמיה חיה in vivo ו-ex vivo ולמעקב ויראלי במודל העכבר המהונדס האנושי K18 של זיהום SARS-CoV-2. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היישום וההיתכנות של זיהוי ומעקב נגיפי למחקרי in vivo ו- ex vivo של SARS-CoV-2 במודל העכבר המהונדס האנושי K18 ACE2. השימוש בהדמיית in vivo של SARS-CoV-2 במודל העכבר המהונדס האנושי K18 ACE2 מייצג אפשרות מצוינת להערכת טיפולים לטיפול בזיהום SARS-CoV-2 in vivo.
יישום של כתבים SARS-CoV-2 מייצגים אפשרות מצוינת להעריך פתוגניות, שכפול נגיפי וטרופיזם in vivo. עבור מחקרי in vivo עם לוציפראז המבטא SARS-CoV-2, מומלץ לגלח את העכברים ולהדמיה מהירה לאחר הזרקת מצע כדי לשפר את אות הביולומינסנציה. התחל ניטור bioluminescence על ידי הפעלת מערכת ההדמיה in vivo, או IVIS, והגדרת הפרמטרים, לחץ על מצב התמונה ל- Bioluminescence ואז פתח את המסנן והגדר את זמן החשיפה ל- Auto.
לאחר מכן, הסר עכבר שכבר מגולח ומורדם מתא הבידוד והשתמש במחט 25 מדים כדי לתת בדיעבד 100 מיקרוליטרים של מצע לוציפראז מדולל 1 עד 10 ב- PBS לעכבר. לאחר מכן החזירו את העכבר לתא הבידוד, העבירו את תא הבידוד למכונת IVIS, המצוידת ברכיב חימום למניעת היפותרמיה, וסגרו את דלת הדמיית IVIS כדי לאתחל את ההדמיה על ידי בחירת Acquire בתוכנה. כדי לנתח את תמונות bioluminescence שנרכשו, השתמש בכלי ROI או באזור העניין בתוכנה כדי לייעד את האות המדויק ולמדוד את השטף.
הפעל את תוכנת ההדמיה והגדר את הפרמטרים. לחץ על מצב התמונה לפלואורסצנציה, הגדר עירור ב- 500 ננומטר ומסנני פליטה ב- 530 ננומטר, והגדר את זמן החשיפה ל- Auto. בצע נמק וריאות בלו מעכברים.
הניחו את הריאות שנכרתו בצלחת של 6 בארות המכילה שני מיליליטרים של 1X PBS ושטפו אותה כדי להסיר עודפי דם. יש לחטא ולנקות את כלי הניתוח בין הדגימות באמצעות 70% אתנול. לאחר אתחול מכונת IVIS, הניחו את הריאות על יריעה שחורה והפרידו את הרקמות זו מזו.
לאחר מכן הניחו את המגש בתוך תא הבידוד בתוך ארון הבטיחות הביולוגית ולאחר מכן העבירו את תא הבידוד ל-IVIS. סגור את דלת הצילום של IVIS ולחץ על רכישה כדי ליזום את מערכת ההדמיה. כדי לנתח פלואורסצנציה, השתמש בכלי ההחזר על ההשקעה וצייר ROIs סביב כל אחת מהריאות הבודדות.
מדוד כל החזר השקעה באופן ידני ולאחר מכן השתמש בערכי היעילות הקורנים הממוצעים שניתנו והפחת מהעכברים הנגועים בדמה. לאחר השלמת ההדמיה, הניחו את הרקמות בקריו-צינורית כדי להקפיא קרח יבש כדי לאחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר. תוך שימוש בסופרנאט המתקבל מההומוגנטים של הרקמה, מבצעים דילול סדרתי פי עשרה ומדביקים מונו-שכבות מפגש של תאי Vero E6 עם מיליליטר אחד של כל דילול סופרנטנטי בטריפליקטים.
תנו לנגיף לספוח במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו-חמצני של 5% לחות. לאחר שסיימו, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של 1X PBS ולאחר מכן דגירו את התאים לשני מיליליטרים של מדיה שלאחר ההדבקה המכילה 1%אגר באינקובטור הפחמן הדו-חמצני 5% הלח ב-37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, השביתו את הלוחות בפורמלין נייטרלי של 10% נייטרלי במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס, מה שמבטיח שהצלחת כולה שקועה.
הוציאו צלחות מרמה שלוש של בטיחות ביולוגית ושטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 0.5% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חסום את התאים החודרים עם מיליליטר אחד של 2.5 אלבומין בסרום בקר או BSA ו- PBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הדגירה במיליליטר אחד של מיקרוגרם אחד למיליליטר של חלבון הנוקליאוקפסיד SARS-CoV נוקליאוקפסיד הנוגדן החד-שבטי המגיב 1C7C7 מדולל ב-2.5 BSA למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 1X PBS ולפתח את הפלאקים באמצעות ABC ו diaminobenzene, או DAB, ערכות מצע peroxidase על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן לחשב את titers ויראלי כיחידות יצירת רובד לכל מיליליטר.
במחקר, נצפה כי הננולוסיפראז הביולומינסנטי, או Nluc, זוהה בקלות ועכברים נגועים ב- rSARS-CoV-2 Nluc, אך לא אלה שנדבקו ב- rSARS-CoV-2 מסוג בר או נגועים מדומה. הניתוחים הכמותיים הראו את עוצמת Nluc בימים שונים לאחר ההדבקה. נגעים גסים על פני הריאה של עכברים הנגועים ב-rSARS-CoV-2 Nluc היו דומים לאלה שבקבוצה הנגועה בטבע rSARS-CoV-2.
בנוסף, זוהו טיטרים נגיפיים והעכברים הנגועים ב-rSARS-CoV-2 Nluc היו דומים לאלה שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 מסוג בר בכל האיברים בימים שונים לאחר ההדבקה. במקביל, פעילות Nluc זוהתה רק באיברים מעכברים נגועים rSARS-CoV-2 Nluc. קבוצה נפרדת של עכברים נגועים מדומים ודבקים בנגיף הייתה במעקב במשך 12 יום אחר שינויים במשקל הגוף ובהישרדותו.
עכברים שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 Nluc וב-rSARS-CoV-2 איבדו עד 25% ממשקל גופם וכולם נכנעו לזיהום נגיפי בין שבעה לשמונה ימים לאחר ההדבקה. לאחר זיהום נוגה rSARS-CoV-2, ביטוי נוגה זוהה בקלות בכל הריאות מעכברים שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 Venus, אך לא מאלה שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 מסוג פראי או מדומה שנדבקו. הניתוחים הכמותיים הראו כי עוצמת נוגה מגיעה לשיאה יומיים לאחר ההדבקה ויורדת במהלך ההדבקה והריאות של עכברים נגועים.
תמונות של פני הריאה חשפו נגעים גסים של עכברים הנגועים ב-rSARS-CoV-2 נוגה היה דומה לזה של עכברים נגועים מסוג rSARS-CoV-2. כמו כן, זיהום עם rSARS-CoV-2 Venus הביא לתגובות נגיפיות דומות לאלה שנצפו בעכברים שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 מסוג בר בכל האיברים. העכברים שנדבקו ב-rSARS-CoV-2 Venus וב-rSARS-CoV-2 איבדו עד 25% ממשקל גופם ונכנעו לזיהום נגיפי ביום התשיעי לאחר ההדבקה ללא הישרדות.
התוצאות של כתבת המבטאת SARS-CoV-2 הראו שהן פונדקאיות תקפות של זיהום ויראלי. לפיכך, זה עלול להוביל לזיהוי והערכה מהירים של אמצעי נגד לטיפול בזיהום SARS-CoV-2.
