Nosso protocolo descreveu o uso de SARS-CoV-2 recombinante fluorescente ou luminescente para detecção viral in vivo e ex vivo e rastreamento viral no modelo de camundongo transgênico ACE2 humano K18 da infecção sars-CoV-2. A principal vantagem dessa técnica é a aplicação e viabilidade da detecção e rastreamento viral para estudos in vivo e ex vivo de SARS-CoV-2 no modelo de camundongo transgênico ACE2 humano K18. O uso da imagem in vivo do SARS-CoV-2 no modelo de camundongo transgênico humano ACE2 K18 representa uma excelente opção para avaliar a terapêutica para o tratamento da infecção por SARS-CoV-2 in vivo.
A implementação dos repórteres SARS-CoV-2 representa uma excelente opção para avaliar patogenicidade, replicação viral e trofema in vivo. Para estudos in vivo com luciferase expressando SARS-CoV-2, raspar os camundongos e prontas imagens após a injeção de substrato é recomendado para melhorar o sinal de bioluminescência. Inicie o monitoramento da bioluminescência iniciando o sistema de imagem in vivo, ou IVIS, e configurando os parâmetros, clique no modo de imagem para Bioluminescência e abra o filtro e defina o tempo de exposição ao Auto.
Em seguida, remova um rato já raspado e anestesiado da câmara de isolamento e use uma agulha de calibre 25 para administrar retro-orbitalmente 100 microliters do substrato de luciferase diluído de 1 a 10 em PBS para o mouse. Em seguida, coloque o mouse de volta para a câmara de isolamento, transfira a câmara de isolamento para a máquina IVIS, que é equipada com um componente de aquecimento para evitar hipotermia, e feche a porta do imager IVIS para inicializar a imagem selecionando a Acquire no programa de software. Para analisar as imagens adquiridas de bioluminescência, utilize o ROI ou a ferramenta região de interesse no software para designar o sinal preciso e medir o fluxo.
Inicie o software de imagem e configure os parâmetros. Clique no modo de imagem para Fluorescência, defina excitação em 500 nanômetros e filtros de emissão em 530 nanômetros e ajuste o tempo de exposição a Auto. Realize necroscopia e excise pulmões de camundongos.
Coloque os pulmões excisados em uma placa de 6 poços contendo dois mililitros de 1X PBS e enxágue para remover o excesso de sangue. Desinfeta e ferramentas de cirurgia limpa entre as amostras usando 70% de etanol. Depois de inicializar a máquina IVIS, coloque os pulmões em uma folha preta e separe os tecidos um do outro.
Em seguida, coloque a bandeja dentro da câmara de isolamento dentro do armário de biossegurança e, em seguida, transfira a câmara de isolamento para o IVIS. Feche a porta do imager IVIS e clique em Adquirir para iniciar o sistema de imagem. Para analisar a fluorescência, utilize a ferramenta ROI e desenhe ROIs em torno de cada um dos pulmões individuais.
Meça cada ROI manualmente e, em seguida, use os valores médios de eficiência radiante dados e subtraia dos ratos infectados por simulação. Uma vez que a imagem esteja completa, coloque os tecidos em um criobotube para congelamento de gelo seco para armazenar a menos 80 graus Celsius para processamento posterior. Utilizando o supernato obtido a partir dos homogeneizadores teciduais, realize diluição serial dez vezes maior e infecte monocamadas confluentes de células Vero E6 com um mililitro de cada diluição sobrenante em triplicados.
Deixe o vírus adsorb por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono. Uma vez feito, lave as células com um mililitro de 1X PBS e, em seguida, incubar as células em dois mililitros de mídia pós-infecção contendo 1% de ágar na incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius por 72 horas. Após a incubação, inative as placas em formalina tamponada 10% neutra por 24 horas a quatro graus Celsius, garantindo que toda a placa esteja submersa.
Tire as placas do nível de biossegurança três e lave as células três vezes com um mililitro de 0,5% Triton X-100 por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, bloqueie as células permeabilizadas com um mililitro de 2,5 gêmontos bovinos albumina ou BSA e PBS por uma hora a 37 graus Celsius seguido de incubação em um mililitro de um micrograma por mililitro da proteína nucleocapsida SARS-CoV anticorpo monoclonal interativo 1C7C7 diluído em 2,5 BSA por uma hora a 37 graus Celsius. Lave as células três vezes com um mililitro de 1X PBS e desenvolva as placas usando o ABC e diaminobenzeno, ou DAB, kits de substrato peroxidase de acordo com as instruções do fabricante, em seguida, calcule os títulos virais como unidades formando placas por mililitro.
No estudo, observou-se que a nanoluciferase bioluminescente, ou Niuc, foi facilmente detectada e os camundongos infectados com o niuc rSARS-CoV-2, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2 selvagem ou infectados simulados. As análises quantitativas mostraram intensidade de Niuc em dias diferentes após a infecção. Lesões brutas na superfície pulmonar de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Niuc foram comparáveis às do grupo infectado do tipo selvagem rSARS-CoV-2.
Além disso, os títulos virais detectados e os camundongos infectados por RSARS-CoV-2 Niuc foram comparáveis aos infectados com rSARS-CoV-2 em todos os órgãos em dias diferentes após a infecção. Ao mesmo tempo, a atividade de Nluc só foi detectada nos órgãos de camundongos infectados por RSARS-CoV-2 Niuc. Um grupo separado de camundongos infectados por simulados e infectados por vírus foi monitorado por 12 dias para mudanças no peso e na sobrevivência do corpo.
Camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Niuc e rSARS-CoV-2 tipo selvagem perderam até 25% de seu peso corporal e todos sucumbem à infecção viral entre sete a oito dias após a infecção. Após a infecção por Vênus rSARS-CoV-2, a expressão de Vênus foi prontamente detectada em todos os pulmões de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Vênus, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2 selvagem ou simulado infectado. As análises quantitativas mostraram que a intensidade de Vênus atinge picos de dois dias após a infecção e diminui ao longo da infecção e dos pulmões de camundongos infectados.
Imagens da superfície pulmonar revelaram lesões brutas de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Vênus era comparável à de camundongos infectados do tipo selvagem rSARS-CoV-2. Além disso, a infecção por rSARS-CoV-2 Vênus resultou em títulos virais comparáveis aos observados em camundongos infectados com rSARS-CoV-2 tipo selvagem em todos os órgãos. Os camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Venus e rSARS-CoV-2 wild-type perderam até 25% de seu peso corporal e sucumbiram à infecção viral até o nono dia pós-infecção sem sobrevivência.
Os resultados do repórter que expressa SARS-CoV-2 mostraram-se substitutos válidos da infecção viral. Assim, isso poderia levar à rápida identificação e avaliação de contramedidas para o tratamento da infecção pelo SARS-CoV-2.
