Nuestro protocolo describió el uso de SARS-CoV-2 recombinante fluorescente o que expresa luminiscente para la detección viral de imágenes en vivo in vivo y ex vivo y el seguimiento viral en el modelo de ratón transgénico ACE2 humano K18 de infección por SARS-CoV-2. La principal ventaja de esta técnica es la aplicación y viabilidad de la detección y seguimiento viral para estudios in vivo y ex vivo del SARS-CoV-2 en el modelo de ratón transgénico ACE2 humano K18. El uso de la imagen in vivo del SARS-CoV-2 en el modelo de ratón transgénico humano ACE2 K18 representa una excelente opción para evaluar la terapéutica para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2 in vivo.
La implementación de reporteros SARS-CoV-2 representa una excelente opción para evaluar la patogenicidad, la replicación viral y el trofismo in vivo. Para estudios in vivo con luciferasa que expresa SARS-CoV-2, se recomienda afeitar a los ratones y obtener imágenes inmediatas después de la inyección de sustrato para mejorar la señal de bioluminiscencia. Comience el monitoreo de bioluminiscencia iniciando el sistema de imágenes in vivo, o IVIS, y configurando los parámetros, haga clic en el modo de imagen a Bioluminiscencia, luego abra el filtro y establezca el tiempo de exposición en Automático.
A continuación, retire un ratón ya afeitado y anestesiado de la cámara de aislamiento y use una aguja de calibre 25 para administrar retroorbitalmente 100 microlitros del sustrato de luciferasa diluido de 1 a 10 en PBS al ratón. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la cámara de aislamiento, transfiera la cámara de aislamiento a la máquina IVIS, que está equipada con un componente de calentamiento para evitar la hipotermia, y cierre la puerta del generador de imágenes IVIS para inicializar la imagen seleccionando Adquirir en el programa de software. Para analizar las imágenes de bioluminiscencia adquiridas, utilice la herramienta ROI o región de interés en el software para designar la señal precisa y medir el flujo.
Inicie el software de imágenes y configure los parámetros. Haga clic en el modo de imagen a Fluorescencia, establezca la excitación en 500 nanómetros y los filtros de emisión a 530 nanómetros, y establezca el tiempo de exposición en Auto. Realice necroscopia e excise pulmones de ratones.
Coloque los pulmones extirpados en una placa de 6 pocillos que contenga dos mililitros de 1X PBS y enjuague para eliminar el exceso de sangre. Desinfectar y limpiar las herramientas quirúrgicas entre las muestras utilizando etanol al 70%. Después de inicializar la máquina IVIS, coloque los pulmones en una sábana negra y separe los tejidos entre sí.
Luego coloque la bandeja dentro de la cámara de aislamiento dentro del gabinete de bioseguridad y luego transfiera la cámara de aislamiento al IVIS. Cierre la puerta del generador de imágenes IVIS y haga clic en Adquirir para iniciar el sistema de imágenes. Para analizar la fluorescencia, utilice la herramienta de ROI y dibuje ROI alrededor de cada uno de los pulmones individuales.
Mida cada ROI manualmente y luego use los valores de eficiencia radiante promedio dados y reste de los ratones infectados simulados. Una vez que se completen las imágenes, coloque los tejidos en un criotubo para congelar el hielo seco para almacenarlos a menos 80 grados celsius para su posterior procesamiento. Utilizando el supernato obtenido de los homogeneizados tisulares, realizar una dilución seriada diez veces mayor e infectar monocapas confluentes de células Vero E6 con un mililitro de cada dilución sobrenadante en triplicados.
Deje que el virus se adsorba durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Una vez hecho esto, lave las células con un mililitro de 1X PBS y luego incube las células en dos mililitros de medios posteriores a la infección que contengan 1% de agar en la incubadora humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 72 horas. Después de la incubación, inactive las placas en formalina tamponada al 10% neutra durante 24 horas a cuatro grados centígrados, asegurando que toda la placa esté sumergida.
Saque las placas del nivel de bioseguridad tres y lave las células tres veces con un mililitro de 0.5%Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee las células permeabilizadas con un mililitro de albúmina sérica bovina 2.5 o BSA y PBS durante una hora a 37 grados Celsius seguido de incubación en un mililitro de un microgramo por mililitro de la proteína nucleocápside SARS-CoV anticuerpo monoclonal de reactiva cruzada 1C7C7 diluido en 2.5 BSA durante una hora a 37 grados Celsius. Lave las células tres veces con un mililitro de 1X PBS y desarrolle las placas utilizando los kits de sustrato de peroxidasa ABC y diaminobenceno, o DAB, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego calcule los títulos virales como unidades formadoras de placa por mililitro.
En el estudio, se observó que la nanoluferasa bioluminiscente, o Nluc, se detectó fácilmente y los ratones infectados con el rSARS-CoV-2 Nluc, pero no los infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje o simulado infectados. Los análisis cuantitativos mostraron la intensidad de Nluc en diferentes días después de la infección. Las lesiones macroscópicas en la superficie pulmonar de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc fueron comparables a las del grupo infectado de tipo salvaje rSARS-CoV-2.
Además, los títulos virales detectados y los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc fueron comparables a los infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje en todos los órganos en diferentes días después de la infección. Al mismo tiempo, la actividad de Nluc solo se detectó en los órganos de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc. Un grupo separado de ratones infectados simulados e infectados por virus fue monitoreado durante 12 días para detectar cambios en el peso corporal y la supervivencia.
Los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc y rSARS-CoV-2 de tipo salvaje perdieron hasta el 25% de su peso corporal y todos sucumbieron a la infección viral entre siete y ocho días después de la infección. Después de la infección por Venus rSARS-CoV-2, la expresión de Venus se detectó fácilmente en todos los pulmones de ratones infectados con Venus rSARS-CoV-2, pero no de aquellos infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje o simulado infectado. Los análisis cuantitativos mostraron que la intensidad de Venus alcanza su punto máximo a los dos días posteriores a la infección y disminuye en el transcurso de la infección y los pulmones de los ratones infectados.
Las imágenes de la superficie pulmonar revelaron que las lesiones macroscópicas de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Venus eran comparables a las de los ratones infectados de tipo salvaje rSARS-CoV-2. Además, la infección con rSARS-CoV-2 Venus resultó en títulos virales comparables a los observados en ratones infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje en todos los órganos. Los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Venus y rSARS-CoV-2 de tipo salvaje perdieron hasta el 25% de su peso corporal y sucumbieron a la infección viral en el noveno día después de la infección sin supervivencia.
Los resultados de los reporteros que expresan SARS-CoV-2 han demostrado ser sustitutos válidos de la infección viral. Por lo tanto, esto podría conducir a una rápida identificación y evaluación de las contramedidas para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2.
