우리의 프로토콜은 SARS-CoV-2 감염의 K18 인간 ACE2 트랜스제닉 마우스 모델에서 생체내 및 생체외 라이브 이미징 바이러스 검출 및 바이러스 추적을 위한 형광 또는 발광 발현 재조합 SARS-CoV-2의 사용을 기술하였다. 이 기술의 주요 장점은 K18 인간 ACE2 트랜스제닉 마우스 모델에서 SARS-CoV-2의 생체내 및 생체외 연구를 위한 바이러스 검출 및 추적의 적용 및 실현 가능성이다. K18 인간 ACE2 트랜스제닉 마우스 모델에서 SARS-CoV-2의 생체내 영상화의 사용은 생체내에서 SARS-CoV-2 감염의 치료를 위한 치료제를 평가하는 우수한 옵션을 나타낸다.
기자 SARS-CoV-2의 구현은 생체 내에서 병원성, 바이러스 복제 및 영양 상태를 평가하는 훌륭한 옵션을 나타냅니다. 루시퍼라아제가 SARS-CoV-2를 발현하는 생체내 연구를 위해, 생쥐를 면도하고 기질 주입 후 신속한 이미징이 생체 발광 신호의 개선을 위해 권장된다. 생체 내 이미징 시스템 또는 IVIS를 시작하고 매개 변수를 설정하고 이미지 모드를 Bioluminescence로 클릭 한 다음 필터를 열고 노출 시간을 Auto로 설정하여 생체 발광 모니터링을 시작하십시오.
다음에, 이미 면도되고 마취된 마우스를 분리 챔버로부터 제거하고, 25 게이지 바늘을 사용하여 PBS로 1 내지 10을 희석한 루시퍼라제 기질 100 마이크로리터를 마우스에 역궤도 투여한다. 그런 다음 마우스를 다시 격리 챔버에 넣고 저체온증을 방지하기 위해 가열 구성 요소가 장착 된 IVIS 기계로 격리 챔버를 옮기고 IVIS 이미저 도어를 닫아 소프트웨어 프로그램에서 획득을 선택하여 이미징을 초기화하십시오. 획득한 생체 발광 이미지를 분석하려면 소프트웨어의 ROI 또는 관심 영역 도구를 활용하여 정확한 신호를 지정하고 플럭스를 측정합니다.
이미징 소프트웨어를 시작하고 매개변수를 설정합니다. 이미지 모드를 형광으로 클릭하고, 여기를 500나노미터로, 방출 필터를 530나노미터로 설정하고, 노출 시간을 Auto. 괴사검사를 실시하고 마우스에서 폐를 절제합니다.
적출된 폐를 1X PBS 2밀리리터가 들어있는 6-웰 플레이트에 놓고 헹구어 과도한 혈액을 제거한다. 70 % 에탄올을 사용하여 샘플 사이의 수술 도구를 소독하고 청소하십시오. IVIS 기계를 초기화 한 후 폐를 검은 색 시트에 놓고 조직을 서로 분리하십시오.
그런 다음 트레이를 생물 안전 캐비닛 내부의 격리 챔버 내부에 놓은 다음 격리 챔버를 IVIS로 옮깁니다. IVIS 이미저 도어를 닫고 획득을 클릭하여 이미징 시스템을 시작합니다. 형광을 분석하려면 ROI 도구를 활용하고 각 폐 주위에 ROI를 그립니다.
각 ROI를 수동으로 측정 한 다음 주어진 평균 방사 효율 값을 사용하고 모의 감염된 마우스에서 뺍니다. 이미징이 완료되면 조직을 드라이 아이스 동결을위한 냉동 튜브에 넣고 나중에 처리 할 수 있도록 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 조직 균질물로부터 수득된 상등물을 이용하여, 열 배 연속 희석을 수행하고, Vero E6 세포의 합류 단층을 삼중 희석된 각 상청액 희석액의 한 밀리리터로 감염시킨다.
바이러스가 가습 된 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 한 시간 동안 흡착되도록하십시오. 일단 완료되면, 세포를 1X PBS의 1 밀리리터로 세척한 다음, 세포를 섭씨 37도에서 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 1%아가를 함유하는 감염 후 배지 2밀리리터에서 72시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 플레이트를 섭씨 4도에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 불활성화시켜, 전체 플레이트가 침수되도록 한다.
플레이트를 생물 안전 수준 3에서 꺼내고 실온에서 10 분 동안 0.5 % Triton X-100 1 밀리리터로 세포를 세 번 씻으십시오. 다음으로, 투과화된 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 2.5 밀리리터의 소 혈청 알부민 또는 BSA 및 PBS로 차단한 다음, 섭씨 37도에서 1시간 동안 2.5 BSA로 희석된 SARS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질 교차반응성 모노클로날 항체 1C7C7을 밀리리터당 1밀리리터의 밀리리터에서 인큐베이션하였다. 1X PBS 1 밀리리터로 세포를 세 번 세척하고 제조업체의 지시에 따라 ABC 및 디아미노벤젠 또는 DAB, 퍼옥시다제 기질 키트를 사용하여 플라크를 개발한 다음, 밀리리터당 플라크 형성 단위로서 바이러스 역가를 계산한다.
이 연구에서, 생체발광 나노루시페라제 또는 Nluc가 쉽게 검출되고 rSARS-CoV-2 Nluc에 감염된 마우스가 관찰되었지만, rSARS-CoV-2에 감염된 마우스는 야생형 또는 모의에 감염되지 않았다. 정량적 분석은 감염 후 다른 날에서 Nluc 강도를 보여주었습니다. rSARS-CoV-2 Nluc에 감염된 마우스의 폐 표면에서의 총체적 병변은 rSARS-CoV-2 야생형 감염군의 병변과 필적하였다.
추가적으로, 검출된 바이러스 역가 및 rSARS-CoV-2 Nluc 감염 마우스는 감염 후 상이한 날에 모든 기관에서 rSARS-CoV-2 야생형으로 감염된 마우스와 비교되었다. 동시에, Nluc 활성은 rSARS-CoV-2 Nluc 감염 마우스로부터의 장기에서만 검출되었다. 모의 감염 및 바이러스 감염 마우스의 분리된 그룹을 체중 및 생존의 변화에 대해 12일 동안 모니터링하였다.
rSARS-CoV-2 Nluc 및 rSARS-CoV-2 야생형에 감염된 마우스는 체중의 최대 25 %를 잃었으며 감염 후 7 일에서 8 일 사이에 바이러스 감염에 굴복했습니다. rSARS-CoV-2 금성 감염 후, 금성 발현은 rSARS-CoV-2 금성에 감염된 마우스로부터 모든 폐에서 쉽게 검출되었지만 rSARS-CoV-2 야생형 또는 모의에 감염된 마우스는 검출되지 않았다. 정량적 분석에 따르면 금성 강도는 감염 후 이틀 만에 최고조에 달하고 감염 과정과 감염된 마우스의 폐에 걸쳐 감소합니다.
폐 표면의 이미지는 rSARS-CoV-2 금성에 감염된 마우스의 총체적 병변을 밝혀 rSARS-CoV-2 야생형 감염 마우스의 병변과 비슷했다. 또한, rSARS-CoV-2 금성에 의한 감염은 모든 장기에서 rSARS-CoV-2 야생형에 감염된 마우스에서 관찰된 것과 유사한 바이러스 역가를 초래하였다. rSARS-CoV-2 금성 및 rSARS-CoV-2 야생형에 감염된 마우스는 체중의 최대 25 %를 잃었고 감염 후 아홉 일째까지 바이러스 감염에 굴복했습니다.
SARS-CoV-2를 발현하는 기자의 결과는 바이러스 감염의 유효한 대리자로 나타났습니다. 따라서 이는 SARS-CoV-2 감염 치료를위한 대책의 신속한 식별 및 평가로 이어질 수 있습니다.
