Il nostro protocollo ha descritto l'uso di SARS-CoV-2 ricombinante fluorescente o luminescente per il rilevamento virale di imaging live in vivo ed ex vivo e il tracciamento virale nel modello murino transgenico ACE2 umano K18 dell'infezione da SARS-CoV-2. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'applicazione e la fattibilità del rilevamento e del tracciamento virale per studi in vivo ed ex vivo di SARS-CoV-2 nel modello murino transgenico ACE2 umano K18. L'uso dell'imaging in vivo di SARS-CoV-2 nel modello murino transgenico DI ACE2 umano K18 rappresenta un'opzione eccellente per valutare le terapie per il trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2 in vivo.
L'implementazione dei reporter SARS-CoV-2 rappresenta un'opzione eccellente per valutare la patogenicità, la replicazione virale e il trofismo in vivo. Per gli studi in vivo con luciferasi che esprime SARS-CoV-2, si raccomanda la rasatura dei topi e l'imaging tempestivo dopo l'iniezione del substrato per migliorare il segnale di bioluminescenza. Iniziare il monitoraggio della bioluminescenza avviando il sistema di imaging in vivo, o IVIS, e impostando i parametri, fare clic sulla modalità immagine su Bioluminescenza, quindi aprire il filtro e impostare il tempo di esposizione su Auto.
Quindi, rimuovere un topo già rasato e anestetizzato dalla camera di isolamento e utilizzare un ago calibro 25 per somministrare retro-orbitalmente 100 microlitri del substrato della luciferasi diluiti da 1 a 10 in PBS al topo. Quindi riposizionare il mouse nella camera di isolamento, trasferire la camera di isolamento alla macchina IVIS, dotata di un componente di riscaldamento per prevenire l'ipotermia, e chiudere lo sportello dell'imager IVIS per inizializzare l'imaging selezionando Acquisisci nel programma software. Per analizzare le immagini di bioluminescenza acquisite, utilizzare lo strumento ROI o regione di interesse nel software per designare il segnale preciso e misurare il flusso.
Avviare il software di imaging e impostare i parametri. Fare clic sulla modalità immagine su Fluorescenza, impostare l'eccitazione a 500 nanometri e i filtri di emissione a 530 nanometri e impostare il tempo di esposizione su Auto. Condurre necroscopia e asportare i polmoni dai topi.
Posizionare i polmoni asportati in una piastra a 6 pozzetti contenente due millilitri di 1X PBS e risciacquare per rimuovere il sangue in eccesso. Disinfettare e pulire gli strumenti chirurgici tra i campioni utilizzando il 70% di etanolo. Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i polmoni su un foglio nero e separare i tessuti l'uno dall'altro.
Quindi posizionare il vassoio all'interno della camera di isolamento all'interno dell'armadio di biosicurezza e quindi trasferire la camera di isolamento all'IVIS. Chiudere la porta dell'imager IVIS e fare clic su Acquisisci per avviare il sistema di imaging. Per analizzare la fluorescenza, utilizzare lo strumento ROI e disegnare ROI attorno a ciascuno dei singoli polmoni.
Misurare manualmente ogni ROI e quindi utilizzare i valori medi di efficienza radiante forniti e sottrarre dai topi finti infetti. Una volta completata l'imaging, posizionare i tessuti in un criotubo per il congelamento del ghiaccio secco da conservare a meno 80 gradi Celsius per una successiva elaborazione. Utilizzando il supernato ottenuto dagli omogeneizzati tissutali, eseguire una diluizione seriale decuplicata e infettare monostrati confluenti di cellule Vero E6 con un millilitro di ciascuna diluizione surnatante in triplicati.
Lasciare che il virus assorba per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%. Una volta fatto, lavare le cellule con un millilitro di 1X PBS e quindi incubare le cellule in due millilitri di mezzi post-infezione contenenti l'1% di agar nell'incubatore di anidride carbonica umidificato al 5% a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo l'incubazione, inattivare le piastre in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore a quattro gradi Celsius, assicurandosi che l'intera piastra sia sommersa.
Estrarre le piastre dal livello di biosicurezza tre e lavare le cellule tre volte con un millilitro di 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, bloccare le cellule permeabilizzate con un millilitro di 2,5 albumina sierica bovina o BSA e PBS per un'ora a 37 gradi Celsius seguita da incubazione in un millilitro di un microgrammo per millilitro dell'anticorpo monoclonale cross-reattivo della proteina nucleocapside SARS-CoV 1C7C7 diluito in 2,5 BSA per un'ora a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con un millilitro di 1X PBS e sviluppare le placche utilizzando i kit di substrato di perossidasi ABC e diaminobenzene, o DAB, secondo le istruzioni del produttore, quindi calcolare i titoli virali come unità di formazione della placca per millilitro.
Nello studio, è stato osservato che la nanoluciferasi bioluminescente, o Nluc, era facilmente rilevabile e i topi infettati con rSARS-CoV-2 Nluc, ma non quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type o finto infettati. Le analisi quantitative hanno mostrato l'intensità di Nluc in diversi giorni dopo l'infezione. Le lesioni grossolane sulla superficie polmonare di topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc erano paragonabili a quelle del gruppo infetto da rSARS-CoV-2 wild-type.
Inoltre, i titoli virali rilevati e i topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc erano paragonabili a quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type in tutti gli organi in diversi giorni dopo l'infezione. Allo stesso tempo, l'attività di Nluc è stata rilevata solo negli organi di topi infetti da rSARS-CoV-2 Nluc. Un gruppo separato di finti topi infetti e infettati da virus è stato monitorato per 12 giorni per i cambiamenti nel peso corporeo e nella sopravvivenza.
I topi infettati da rSARS-CoV-2 Nluc e rSARS-CoV-2 wild-type hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e tutti soccombono all'infezione virale tra sette e otto giorni dopo l'infezione. Dopo l'infezione da Venere rSARS-CoV-2, l'espressione di Venere è stata prontamente rilevata in tutti i polmoni da topi infetti da rSARS-CoV-2 Venere, ma non quelli infettati da rSARS-CoV-2 wild-type o finto infetti. Le analisi quantitative hanno mostrato che l'intensità di Venere raggiunge il picco a due giorni dopo l'infezione e diminuisce nel corso dell'infezione e dei polmoni dei topi infetti.
Le immagini della superficie polmonare hanno rivelato lesioni grossolane di topi infetti da rSARS-CoV-2 Venere era paragonabile a quella di topi infetti da rSARS-CoV-2 wild-type. Inoltre, l'infezione da rSARS-CoV-2 Venus ha provocato titoli virali comparabili a quelli osservati nei topi infetti da rSARS-CoV-2 wild-type in tutti gli organi. I topi infettati da rSARS-CoV-2 Venus e rSARS-CoV-2 wild-type hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e soccombono all'infezione virale entro il nono giorno dopo l'infezione senza sopravvivenza.
I risultati del reporter che esprime SARS-CoV-2 hanno dimostrato di essere validi surrogati dell'infezione virale. Pertanto, ciò potrebbe portare a una rapida identificazione e valutazione delle contromisure per il trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2.
