يمكن أن يساعد هذا البروتوكول المشاركين في مجتمع البطيخ على تقييم مسببات أمراض ذبول الفيوزاريوم ، وهذا سيساعد في تحديد مجموعات مسببات الأمراض الموجودة ويساعد في إدارتها بفعالية. إن ذبول الفيوزاريوم في كتابة العرق معقد ويستغرق وقتا طويلا لإكماله ، ووجود ثلاثة خيارات قابلة للتطبيق للفحص الحيوي لكتابة السباق سيسمح للمستخدمين باختيار الطريقة الأنسب لظروفهم التجريبية. تساعد جميع الطرق الثلاث ممارسي صحة النبات على تشخيص الشدة المحتملة لعدوى ذبول الفيوزاريوم المتعلقة بعزل معين.
وتمكن هذه المعلومات من اتخاذ قرارات مستنيرة وفعالة لإدارة الأمراض المتكاملة. لبدء التحضير للزراعة ، املأ مسطحات بدء الخلايا 8 × 16 بوسط الزراعة أثناء النقر لأسفل لضغط التربة. ثم ، زرع البذور مع قمتها تشير إلى أعلى إلى عمق يساوي طولها.
بعد زرع البذور ، قم بتغطية الوسط الذي يحتوي على البذور المدفونة بأرض فولر على عمق 0.3175 إلى 0.635 سم ، ثم قم برش المسطحات لترطيب الوسط دون إنشاء مياه دائمة أو مجمعة. بعد ذلك ، حافظ على رطوبة الوسط عن طريق التغشية لمدة 20 ثانية كل 180 دقيقة لمدة خمسة أيام حتى إنبات البذور. بعد الإنبات ، سقي الشقق مرة واحدة في اليوم.
بعد خمسة أيام من الزراعة، ضع الأقراص الورقية المخترقة التي يتراوح قطرها من 1 إلى 1.25 سم والتي تحتوي على عزل أوكسي سبوروم الفيوزاريوم المفضل على وسط عصير V8 واضح و 1/4 أجار سكر العنب للبطاطس، أو لوحة وسائط QPDA، لتخزينها في حاضنة عند 28 درجة مئوية لمدة ثمانية أيام. في اليوم الثامن ، انقل صفائح V8 و QPDA إلى خزانة السلامة البيولوجية قبل إزاحة الكونيديا عن طريق كشط موزع خلايا معقم عبر السطح المتوسط وتجميع تعليق كونيديا السائل في أنبوب استزراع معقم سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بقياس عدد البوغ وإعداد محلول التلقيح النهائي عن طريق نقل الحجم المحسوب لحوالي 1 مليون جراثيم إلى أنبوب الاستزراع المعقم الطازج ورفع الحجم الإجمالي إلى 30 ملليلتر بالماء المعقم منزوع الأيونات.
للتحضير للتلقيح ، ضع مسطحات الستايروفوم الخلوية 6x12 التي تم تعقيمها مسبقا باستخدام 10٪ من المبيض وشطفها جيدا لتلقي النباتات الملقحة. قبل عدة ساعات من التلقيح ، سقي النباتات جيدا. بعد ساعتين من الري ، قم بإزالة النباتات من مسطحات الستايروفوم ذات الخلايا 8 × 16 وشطف جذورها.
ثم ، قم بتخزين النباتات المغسولة مؤقتا في حاويات نظيفة بمياه الصنبور حتى الاستخدام ، مع الحفاظ على الأصناف منفصلة عن بعضها البعض. في وقت لاحق ، افصل النباتات إلى مجموعات من ستة أفراد واحتفظ بمجموعات الشتلات ملفوفة في مناشف ورقية مبللة على صينية مختبر. ضع 25 إلى 30 سنتيمترا مكعبا من التربة في قاع كل خلية من صينية الستايروفوم 6x12 واستخدم زجاجة بخاخ لترطيب التربة حتى تصبح رطبة بشكل واضح.
بدءا من التحكم الصحي ، ضع مجموعة من الشتلات الست غير التالفة من نفس الصنف في أنابيب 50 ملليلتر التي تحتوي على اللقاح. للتلقيح ، دوامة أنابيب النباتات مع جذور مغمورة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، ضع نباتا واحدا لكل خلية في مسطحات الستايروفوم 6 × 12 مع نباتات نفس الصنف في عمود واحد من الدرج.
قم بتغطية النباتات بوسط الزراعة واضبطها بلطف. استخدم حقنة لترطيب النبات ب 20 ملليلتر من الماء مع تجنب الرش. عندما يتم إعادة زراعة جميع النباتات ، ضع النباتات بين عشية وضحاها في بيئة مظلمة مغلقة بمتوسط درجة حرارة 27 درجة مئوية.
لإصابة النواة ، قم بإعداد التلقيح عن طريق عزل وزراعة سلالة الفيوزاريوم أوكسيسبوروم نيفيوم على صفيحة من QPDA لدرجة أن نموها يغطي نصف اللوحة. قم بإعداد الحبات عن طريق إضافة ماء صنبور معقم إلى قوارير Erlenmeyer الزجاجية سعة لتر واحد والتي تحتوي على 200 جرام من الحبوب لتغطية الحبوب بالكامل حتى خمسة سنتيمترات على الأقل. بعد نقع الحبوب في القوارير عند 24 درجة مئوية لمدة ساعتين ، قم بتصريف الماء من القارورة وقم بتوصيل فتحة القارورة بقطعة من لفائف القطن ملفوفة بقطعة قماش جبنة قبل تغطية الفتحة بغلاف رقائق الألومنيوم.
قم بتعقيم القوارير في الأوتوكلاف على دورة جاذبية لمدة ساعة واحدة مع وقت تجفيف لمدة خمس دقائق ، ثم اترك القوارير تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. انقل الحبوب إلى كيس زراعة الفطر باستخدام فلتر. قم بإزالة الهواء من الكيس ثم قم بطي البلاستيك الزائد حوله.
ضع الكيس في صندوق بلاستيكي آمن للأوتوكلاف وقم بتغطية الحاوية بغلاف من رقائق الألومنيوم ، ثم قم بالأوتوكلاف مرة أخرى باستخدام نفس الإعدادات كما كان من قبل. بعد التعقيم ، اسمح للفطريات بالاحتضان على الحبات في الكيس لمدة ثلاثة أسابيع. استخدم تجويف فلين معقم بالحجم الرابع لقطع أقراص أجار قطرها ستة ملليمترات من منطقة النمو النشط على لوحة الزرع.
قم بفتح الحقيبة لوضع خمسة أقراص أجار بتقنية معقمة صارمة. استخدم أسطوانة متدرجة معقمة سعة 50 ملليلتر لقياس وإضافة 35 ملليلتر من ماء الصنبور المعقم إلى الحقيبة. املأ وعاءا بلاستيكيا بمزيج من الأواني ثم أضف الكمية المقاسة من مزيج الأواني في كيس بلاستيكي كبير يحتوي على 14 حبة من حبات موبوءة.
قم بإنشاء وسادة هوائية في الكيس وأغلقها قبل خلط الحبوب والتربة عن طريق عكس الكيس عدة مرات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، املأ وعاءا معقما على السطح بخليط التربة الموبوء. كرر العملية لكل صنف من أنواع البطيخ المتبقية لما مجموعه أربعة أواني كاملة من التربة الموبوءة لكل عزل يتم اختباره.
بعد ذلك ، زرع ستة بذور البطيخ في وعاء مع نهاية قمة البذور التي تواجه لأعلى. باستخدام زجاجة رذاذ ، بلل الجزء العلوي من 0.3 إلى 0.6 سم من التربة بالماء ثم ضع طبقا بلاستيكيا شفافا تحت وفوق كل وعاء. املأ 48 إدراج خلية بالرمل المبستر بالبخار والخث والفيرميكوليت بنسبة 4: 1: 1 واضغط على الإدخالات لضغط التربة.
ثم ، ضع الإدخالات في صواني بلاستيكية وزرع البذور كما هو موضح سابقا. قبل سبعة أيام من الزراعة، قم بتلقيح خمس لوحات QPDA بورق متسلل لتخزينها في منطقة محتضنة لمدة ثمانية أيام في دورة مظلمة مدتها 14 ساعة / 10 ساعات. في اليوم السابع ، انقل قابسين أجار بمساحة سنتيمتر مربع واحد إلى كل قارورة Erlenmeyer سعة 250 ملليلتر تحتوي على 100 ملليلتر من سكر العنب البطاطس وضع قوارير Erlenmeyer على شاكر على الطاولة.
في يوم التلقيح ، قم بحصاد الجراثيم عن طريق تصفية اللقاح من خلال أربع طبقات من قماش الجبن المعقم لتحديد التركيز المخروطي الدقيق للقارورة. بعد 14 يوما من البذر ، انقل إدخالات الخلية مع الشتلات إلى صينية شبكية ، ثم ضع صينية شبكية مع الشتلات في حوض بلاستيكي يحتوي على سبعة لترات من تعليق اللقاح. بعد 15 دقيقة من الحفاظ على اللقاح دون إزعاج ، انقل إدخالات الخلية التي تحتوي على الشتلات الملقحة إلى صواني خالية من الثقوب وضع الصواني الخالية من الثقوب على مقعد الدفيئة ، تليها الري حسب الحاجة.
الحفاظ على الإضاءة والظروف البيئية كما هو موضح سابقا للفحص الحيوي لتراجع الجذر. اعتمادا على الطريقة المستخدمة ، ابدأ التصنيف من خلال مراقبة وحساب حدوث الذبول وموت النبات والتقاط صور رقمية لتوثيق تقدم المرض. في طريقة غمس الدرج المعدلة ، أظهرت أصناف Black Diamond و Charleston Gray المصابة بعزل Race-2 أعراضا حادة وماتت.
في المقابل ، أظهر صنف Citrullus amarus PI مقاومة. في طريقة غمس الجذر ، نجت الشتلات المصابة بعزل عرق-0 في الغالب ، في حين ماتت جميع الشتلات المصابة بعزل عرق-3 تقريبا. في طريقة النواة الموبوءة ، بدأت أصناف Sugar Baby و Charleston Gray المزروعة في التربة الموبوءة بالعرق 2 في الذبول والموت ، في حين أن نباتات Citrullus amarus PI لا تزال تبدو صحية.
تذكر أن تزرع النباتات وتحافظ عليها بشكل مناسب ، وتحقق من عزل العامل الممرض للتأكد من صلاحيته ، وفهم التقنيات الفريدة لكل طريقة تلقيح ، وكن متسقا عند تقييم أعراض المرض. مع نتائج هذه الطرق ، يمكن للباحثين التحقيق في المحددات الجينية الأساسية التي تحكم تعبير التباين التفاضلي بين العزلات من خلال التسلسل وتحليل الجينوم المقارن. باستخدام هذه الأساليب ، تمكن الباحثون من تقييم انتشار الأنماط الظاهرية المختلفة للضراوة عبر مواقع مختلفة ومقارنة هذه الأنماط الظاهرية بالعناصر الوراثية التي يمكن ملاحظتها.
