Este protocolo puede ayudar a los involucrados en la comunidad de sandías a evaluar el patógeno del marchitamiento por fusarium, y esto ayudará a determinar las poblaciones de patógenos que están presentes y ayudará a manejarlo de manera efectiva. El marchitamiento por fusarium de tipificación de raza es complejo y requiere mucho tiempo completarlo, y tener tres opciones viables de bioensayo de tipificación de razas permitirá a los usuarios elegir el método más adecuado para sus condiciones experimentales. Los tres métodos ayudan a los profesionales de la salud vegetal a diagnosticar la gravedad potencial de las infecciones por marchitamiento por fusarium relacionadas con un aislado específico.
Esta información permite tomar decisiones informadas y eficaces de gestión integrada de enfermedades. Para comenzar la preparación para la siembra, llene los pisos de inicio de celdas 8x16 con medio de siembra mientras golpea hacia abajo para comprimir el suelo. Luego, siembre semillas con su ápice apuntando hacia arriba a una profundidad igual a su longitud.
Después de sembrar las semillas, cubra el medio que contiene las semillas enterradas con la tierra de Fuller a una profundidad de 0.3175 a 0.635 centímetros, y luego rocíe los pisos para humedecer el medio sin crear agua de pie o acumulada. Después, mantenga el medio húmedo nebulizando durante 20 segundos cada 180 minutos durante cinco días hasta la germinación de la semilla. Después de la germinación, riegue los pisos una vez al día.
Cinco días después de la siembra, coloque discos de papel infiltrados de 1 a 1,25 centímetros de diámetro que contengan el aislado de fusarium oxysporum preferido sobre un medio de jugo V8 clarificado y agar dextrosa de papa de 1/4 de fuerza, o placa de medios QPDA, para almacenarlos en una incubadora a 28 grados Celsius durante ocho días. En el octavo día, transfiera las placas V8 y QPDA a un gabinete de bioseguridad antes de desalojar los conidios raspando un esparcidor de células estériles a través de la superficie media y acumule la suspensión de conidios líquidos en un tubo de cultivo estéril de 50 mililitros. A continuación, cuantifique los recuentos de esporas y prepare la solución final de inóculo transfiriendo el volumen calculado de alrededor de 1 millón de esporas al tubo de cultivo estéril fresco y llevando el volumen total a 30 mililitros con agua desionizada estéril.
Para prepararse para la inoculación, coloque planos de espuma de poliestireno de 6x12 celdas previamente desinfectados con lejía al 10% y bien enjuagados para recibir las plantas inoculadas. Varias horas antes de la inoculación, riegue bien las plantas. Dos horas después del riego, retire las plántulas de las planicies de espuma de poliestireno de células 8x16 y enjuague sus raíces.
Luego, almacene temporalmente las plantas enjuagadas en recipientes limpios con agua del grifo hasta su uso, manteniendo los cultivares separados entre sí. Más tarde, separe las plántulas en grupos de seis individuos y mantenga los grupos de plántulas envueltos en toallas de papel húmedas en una bandeja de laboratorio. Coloque de 25 a 30 centímetros cúbicos de tierra en el fondo de cada celda de la bandeja de espuma de poliestireno de matriz 6x12 y use una botella de chorro para mojar el suelo hasta que esté visiblemente húmedo.
Comenzando con el control saludable, coloque un grupo de las seis plántulas no dañadas del mismo cultivar en los tubos de 50 mililitros que contienen el inóculo. Para inocular, vórtice los tubos de las plántulas con raíces sumergidas durante 30 segundos. A continuación, coloque una sola plántula por celda en los pisos de espuma de poliestireno 6x12 con las plantas del mismo cultivar en una columna de la bandeja.
Cubra las plántulas con el medio de siembra y cuaje suavemente. Use una jeringa para mojar la plántula con 20 mililitros de agua mientras evita salpicaduras. Cuando todas las plántulas hayan sido replantadas, colóquelas durante la noche en un ambiente oscuro cerrado con una temperatura promedio de 27 grados centígrados.
Para infestar los granos, prepare el inóculo aislando y cultivando una cepa de fusarium oxysporum niveum en una placa de QPDA hasta el punto de que su crecimiento cubra la mitad de la placa. Prepare los granos agregando agua del grifo estéril a los matraces Erlenmeyer de vidrio de un litro que contienen 200 gramos de granos para cubrir completamente los granos hasta al menos cinco centímetros. Después de remojar los granos en los matraces a 24 grados centígrados durante dos horas, escurra el agua del matraz y tapone la abertura del matraz con un trozo de rollo de algodón envuelto en un paño de queso antes de cubrir la abertura con una envoltura de papel de aluminio.
Esterilizar los matraces en el autoclave en un ciclo de gravedad durante una hora con cinco minutos de tiempo de secado, luego dejar que los matraces se enfríen a temperatura ambiente. Transfiera los granos a una bolsa de cultivo de hongos con un filtro. Retire el aire de la bolsa y luego doble el exceso de plástico a su alrededor.
Coloque la bolsa en un contenedor de plástico apto para autoclave y cubra el contenedor con una envoltura de papel de aluminio, luego vuelva a colocarla en autoclave utilizando la misma configuración que antes. Después del autoclave, permita que el hongo se incube en los granos en la bolsa durante tres semanas. Use un orificio de corcho estéril del tamaño número cuatro para cortar discos de agar de seis milímetros de diámetro de la zona de crecimiento activo en la placa de cultivo.
Despliega la bolsa para colocar cinco discos de agar con una estricta técnica estéril. Use un cilindro graduado estéril de 50 mililitros para medir y agregue 35 mililitros de agua del grifo estéril a la bolsa. Llene una olla de plástico con una mezcla para macetas y luego agregue la cantidad medida de mezcla para macetas en una bolsa de plástico grande que contenga 14 granos de granos infestados.
Cree un cojín de aire en la bolsa y séllelo cerrado antes de mezclar los granos y el suelo invirtiendo la bolsa varias veces. Una vez hecho esto, llene una maceta esterilizada por la superficie con la mezcla de tierra infestada. Repita el proceso para cada variedad de sandía restante para un total de cuatro macetas llenas de tierra infestada por aislado que se esté probando.
A continuación, siembre seis semillas de sandía en la maceta con el extremo del ápice de la semilla hacia arriba. Usando una botella de spray, humedezca los 0.3 a 0.6 centímetros superiores de tierra con agua y luego coloque un plato de plástico transparente debajo y sobre cada maceta. Llene 48 insertos de celdas con arena pasteurizada al vapor, turba, vermiculita en la proporción 4: 1: 1 y toque los insertos para comprimir el suelo.
Luego, coloque los insertos en bandejas de plástico y siembre las semillas como se explicó anteriormente. Siete días antes de plantar, inocule cinco placas QPDA con papel infiltrado para almacenarlas en un área incubada durante ocho días en un ciclo oscuro de 14 horas / 10 horas. En el séptimo día, transfiera dos tapones de agar de un centímetro cuadrado a cada matraz Erlenmeyer de 250 mililitros que contenga 100 mililitros de dextrosa de papa y coloque los matraces Erlenmeyer en una batidora de sobremesa.
En el día de la inoculación, cosecha las esporas filtrando el inóculo a través de cuatro capas de tela de queso estéril para determinar la concentración microconidial del matraz. 14 días después de la siembra, transfiera los insertos de celda con las plántulas a la bandeja palmeada, luego coloque la bandeja palmeada con las plántulas en una tina de plástico que contenga los siete litros de suspensión de inóculo. Después de 15 minutos de mantener el inóculo sin perturbaciones, transfiera los insertos de celda que contienen las plántulas inoculadas a bandejas sin agujeros y coloque las bandejas sin agujeros en el banco del invernadero, seguido de regar según sea necesario.
Mantenga las condiciones de iluminación y ambientales como se describió anteriormente para el bioensayo de inmersión radicular. Dependiendo del método utilizado, comience la calificación observando y calculando la incidencia de marchitez y muerte de las plantas y tome imágenes digitales para documentar el progreso de la enfermedad. En el método de inmersión en bandeja modificado, los cultivares Black Diamond y Charleston Gray infectados con un aislado de raza 2 mostraron síntomas graves y murieron.
En contraste, el cultivar Citrullus amarus PI mostró resistencia. En el método de inmersión de la raíz, las plántulas infectadas con un aislado de raza 0 sobrevivieron en su mayoría, mientras que casi todas las plántulas infectadas con un aislado de raza 3 murieron. En el método del grano infestado, los cultivares Sugar Baby y Charleston Gray cultivados en suelo infestado de raza 2 han comenzado a marchitarse y morir, mientras que las plantas de Citrullus amarus PI todavía parecen saludables.
Recuerde sembrar y mantener las plantas de manera adecuada, verificar la viabilidad del aislado patógeno, comprender las técnicas únicas de cada método de inoculación y ser consistente al evaluar los síntomas de la enfermedad. Con los resultados de estos métodos, los investigadores pueden investigar los determinantes genéticos subyacentes que gobiernan la expresión de varianza diferencial entre los aislados a través de la secuenciación y el análisis genómico comparativo. Usando estos métodos, los investigadores han podido evaluar la prevalencia de diferentes fenotipos de virulencia en diferentes ubicaciones y comparar estos fenotipos con elementos genéticos observables.
