Questo protocollo può aiutare coloro che sono coinvolti nella comunità dell'anguria a valutare il patogeno dell'appassimento del fusarium, e questo aiuterà a determinare le popolazioni di agenti patogeni presenti e aiuterà a gestirlo in modo efficace. L'appassimento del fusarium a tipizzazione della razza è complesso e richiede tempo per essere completato, e avere tre opzioni di biotest di tipizzazione della razza praticabili consentirà agli utenti di scegliere un metodo più adatto alle loro condizioni sperimentali. Tutti e tre i metodi aiutano i professionisti della salute delle piante a diagnosticare la potenziale gravità delle infezioni da fusarium wilt correlate a un isolato specifico.
Queste informazioni consentono decisioni informate ed efficaci di gestione integrata della malattia. Per iniziare la preparazione per la semina, riempire gli appartamenti di partenza delle celle 8x16 con il mezzo di semina mentre si tocca per comprimere il terreno. Quindi, semina i semi con il loro apice rivolto verso l'alto ad una profondità pari alla loro lunghezza.
Dopo che i semi sono stati seminati, coprire il mezzo contenente i semi sepolti con la terra di Fuller ad una profondità di 0,3175-0,635 centimetri, quindi nebulizzare gli appartamenti per smorzare il mezzo senza creare acqua stagnante o di raccolta. Successivamente, mantenere il mezzo umido nebulizzando per 20 secondi ogni 180 minuti per cinque giorni fino alla germinazione dei semi. Dopo la germinazione, innaffia gli appartamenti una volta al giorno.
Cinque giorni dopo la semina, posizionare dischi di carta infiltrati da 1 a 1,25 centimetri di diametro contenenti l'isolato di fusarium oxysporum preferito su un mezzo di succo V8 chiarificato e 1/4 di agar destrosio di patate di forza, o piastra di supporto QPDA, per conservarli in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per otto giorni. L'ottavo giorno, trasferire le piastre V8 e QPDA in un armadio di biosicurezza prima di rimuovere i conidi raschiando uno spandicelle sterile sulla superficie media e raggruppare la sospensione liquida di conidia in un tubo di coltura sterile da 50 millilitri. Successivamente, quantificare il conteggio delle spore e preparare la soluzione finale di inoculo trasferendo il volume calcolato di circa 1 milione di spore al tubo di coltura sterile fresco e portando il volume totale a 30 millilitri con acqua deionizzata sterile.
Per prepararsi all'inoculazione, posizionare piatti in polistirolo a celle 6x12 precedentemente igienizzati con candeggina al 10% e ben risciacquati per ricevere le piante inoculate. Diverse ore prima dell'inoculazione, innaffiare accuratamente le piante. Due ore dopo l'irrigazione, rimuovere le piantine dalle piastre di polistirolo a cellule 8x16 e risciacquare le radici.
Quindi, conservare temporaneamente le piante risciacquate in contenitori puliti con acqua di rubinetto fino all'uso, mantenendo le cultivar separate l'una dall'altra. Successivamente, separare le piantine in gruppi di sei individui e tenere i gruppi di piantine avvolti in asciugamani di carta bagnati su un vassoio da laboratorio. Posizionare da 25 a 30 centimetri cubi di terreno sul fondo di ogni cella del vassoio di polistirolo array 6x12 e utilizzare una bottiglia di schizzo per bagnare il terreno fino a quando non è visibilmente umido.
A partire dal controllo sano, posizionare un gruppo delle sei piantine non danneggiate della stessa cultivar nei tubi da 50 millilitri contenenti l'inoculo. Per inoculare, vortice i tubi delle piantine con le radici sommerse per 30 secondi. Quindi, posizionare una singola piantina per cella nelle piastre di polistirolo 6x12 con le piante della stessa cultivar in una colonna del vassoio.
Coprire le piantine con terreno di semina e impostare delicatamente. Utilizzare una siringa per bagnare la piantina con 20 millilitri di acqua evitando schizzi. Quando tutte le piantine sono state ripiantate, posizionare le piantine durante la notte in un ambiente buio chiuso con una temperatura media di 27 gradi Celsius.
Per infestare i chicchi, preparare l'inoculo isolando e coltivando un ceppo di fusarium oxysporum niveum su una piastra di QPDA al punto che la sua crescita copre metà della piastra. Preparare i chicchi aggiungendo acqua di rubinetto sterile alle fiasche di vetro Erlenmeyer da un litro contenenti 200 grammi di noccioli per coprire completamente i chicchi fino ad almeno cinque centimetri. Dopo aver immerso i chicchi nei palloni a 24 gradi Celsius per due ore, scolare l'acqua dal pallone e tappare l'apertura del pallone con un pezzo di rotolo di cotone avvolto in un panno per formaggio prima di coprire l'apertura con un involucro di alluminio.
Sterilizzare i palloni in autoclave su un ciclo a gravità per un'ora con cinque minuti di asciugatura, quindi lasciare raffreddare i palloni a temperatura ambiente. Trasferire i grani in un sacchetto di coltivazione di funghi con un filtro. Rimuovere l'aria dal sacchetto e quindi piegare la plastica in eccesso intorno ad esso.
Metti il sacchetto in un bidone di plastica sicuro per l'autoclave e copri il cestino con un involucro di alluminio, quindi autoclave di nuovo usando le stesse impostazioni di prima. Dopo l'autoclave, lasciare che il fungo incuba sui chicchi nella borsa per tre settimane. Utilizzare un foro di sughero sterile di dimensioni numero quattro per tagliare dischi di agar di sei millimetri di diametro dalla zona di crescita attiva sulla piastra di coltura.
Aprire il sacchetto per posizionare cinque dischi di agar con una rigorosa tecnica sterile. Utilizzare un cilindro graduato sterile da 50 millilitri per misurare e aggiungere 35 millilitri di acqua di rubinetto sterile al sacchetto. Riempire una pentola di plastica con una miscela di invasatura e quindi aggiungere la quantità misurata di miscela di invasatura in un grande sacchetto di plastica contenente 14 grani di chicchi infestati.
Creare un cuscino d'aria nel sacchetto e sigillarlo chiuso prima di mescolare i chicchi e il terreno invertendo il sacchetto più volte. Una volta fatto, riempi una pentola sterilizzata in superficie con la miscela di terreno infestata. Ripetere il processo per ogni varietà di anguria rimanente per un totale di quattro vasi pieni di terreno infestato per isolato da testare.
Quindi, semina sei semi di anguria nella pentola con l'estremità apice del seme rivolta verso l'alto. Usando un flacone spray, bagnare la parte superiore da 0,3 a 0,6 centimetri di terreno con acqua e quindi posizionare un piatto di plastica trasparente sotto e sopra ogni pentola. Riempire 48 inserti cellulari con sabbia pastorizzata a vapore, torba, vermiculite nel rapporto 4: 1: 1 e toccare gli inserti per comprimere il terreno.
Quindi, posizionare gli inserti in vassoi di plastica e seminare i semi come spiegato in precedenza. Sette giorni prima di piantare, inoculare cinque lastre QPDA con carta infiltrata per conservarle in un'area incubata per otto giorni su un ciclo buio di 14 ore / 10 ore. Il settimo giorno, trasferire due tappi di agar di un centimetro quadrato in ogni matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri contenente 100 millilitri di destrosio di patate e posizionare i palloni Erlenmeyer su uno shaker da banco.
Il giorno dell'inoculazione, raccogliere le spore filtrando l'inoculo attraverso quattro strati di stoffa di formaggio sterile per determinare la concentrazione microconidiale del pallone. 14 giorni dopo la semina, trasferire gli inserti cellulari con le piantine nel vassoio palmato, quindi posizionare il vassoio palmato con le piantine in una vasca di plastica contenente i sette litri di sospensione dell'inoculo. Dopo 15 minuti di mantenimento indisturbato dell'inoculo, trasferire gli inserti cellulari contenenti le piantine inoculate in vassoi senza fori e posizionare i vassoi senza fori sul banco della serra, seguiti dall'irrigazione secondo necessità.
Mantenere l'illuminazione e le condizioni ambientali come descritto in precedenza per il saggio biologico di immersione radicale. A seconda del metodo utilizzato, iniziare la valutazione osservando e calcolando l'incidenza di appassimento e morte delle piante e scattare immagini digitali per documentare il progresso della malattia. Nel metodo di immersione del vassoio modificato, le cultivar Black Diamond e Charleston Gray infettate da un isolato di razza-2 hanno mostrato sintomi gravi e sono morte.
Al contrario, la cultivar Citrullus amarus PI ha mostrato resistenza. Nel metodo di immersione delle radici, le piantine infettate da un isolato di razza-0 sono per lo più sopravvissute, mentre quasi tutte le piantine infettate da un isolato di razza-3 sono morte. Nel metodo del kernel infestato, le cultivar Sugar Baby e Charleston Gray coltivate in terreni infestati da razza 2 hanno iniziato ad appassire e morire, mentre le piante di Citrullus amarus PI appaiono ancora sane.
Ricorda di seminare e mantenere le piante in modo appropriato, controllare l'isolato patogeno per la vitalità, comprendere le tecniche uniche di ciascun metodo di inoculazione ed essere coerente quando si valutano i sintomi della malattia. Con i risultati di questi metodi, i ricercatori possono studiare i determinanti genetici sottostanti che regolano l'espressione della varianza differenziale tra gli isolati attraverso il sequenziamento e l'analisi genomica comparativa. Utilizzando questi metodi, i ricercatori sono stati in grado di valutare la prevalenza di diversi fenotipi di virulenza in diverse località e confrontare questi fenotipi con elementi genetici osservabili.
