このプロトコルは、スイカのコミュニティに関与する人々がフザリウム萎凋病原体を評価するのに役立ち、これは存在する病原体集団を決定し、それを効果的に管理するのに役立ちます。レースタイピングフザリウムの萎凋病は複雑で完了に時間がかかり、3つの実行可能なレースタイピングバイオアッセイオプションを持つことで、ユーザーは実験条件に最も適した方法を選択できます。3つの方法はすべて、植物医療従事者が特定の分離株に関連するフザリウムしおれん感染の潜在的な重症度を診断するのに役立ちます。
この情報により、情報に基づいた効果的な統合疾患管理の決定が可能になります。植え付けの準備を開始するには、8x16セルのスタートフラットを植え付け用培地で満たし、タップダウンして土壌を圧縮します。それから、その頂点が上を向いてその長さに等しい深さに種を蒔きます。
種を蒔いた後、埋もれた種子を含む培地をフラーの土で0.3175〜0.635センチメートルの深さまで覆い、次いで平らな平らな部分を霧状にして、水を立たせたり溜めたりすることなく培地を湿らせます。その後、種子が発芽するまで5日間、180分毎に20秒間ミストを塗って培地を湿らせておく。発芽後、1日1回平らに水をやる。
植え付けから5日後、好ましいフザリウムオキシスポラム分離物を含む直径1〜1.25センチメートルの浸潤紙ディスクを、1つの清澄化されたV8ジュース培地および1/4強度のジャガイモデキストロース寒天培地、またはQPDA培地プレート上に置き、それらを摂氏28度のインキュベーターに8日間保存する。8日目に、V8プレートとQPDAプレートをバイオセーフティキャビネットに移してから、培地表面を横切って滅菌細胞スプレッダーを掻き取り、液体分生子懸濁液を滅菌50ミリリットル培養チューブにプールして分生子を脱落させた。次に、胞子数を定量し、計算された約100万個の胞子の体積を新鮮な滅菌培養チューブに移し、滅菌脱イオン水で総体積を30ミリリットルにすることによって、最終的な接種剤溶液を調製する。
接種の準備をするには、10%の漂白剤で以前に消毒した6x12セルの発泡スチロールフラットを置き、接種された植物を受け取るためによくすすいでください。接種の数時間前に、植物に十分に水をまきます。散水から2時間後、8x16セルの発泡スチロールの平らから小植物を取り除き、根をすすいでください。
その後、使用時まで水道水でリンスした植物を清潔な容器に一時的に保管し、栽培品種を互いに分離したままにする。その後、小植物を6人のグループに分け、苗木のグループを濡れたペーパータオルで包んでラボトレイに保管します。6x12アレイ発泡スチロールトレイの各セルの底に25〜30立方センチメートルの土壌を置き、ホヤボトルを使用して、目に見えて湿るまで土壌を濡らします。
健康な対照から始めて、同じ品種の損傷を受けていない6本の苗木のグループを接種物を含む50ミリリットルのチューブに入れる。接種するには、根を30秒間沈めた小植物のチューブを渦巻きます。次に、トレイの1つの列に同じ品種の植物と一緒に6x12発泡スチロールのフラットに細胞ごとに1つの小植物体を置きます。
プラントレットを植え付け用培地で覆い、穏やかにセットします。シリンジを使用して、飛沫を避けながら20ミリリットルの水で植物を濡らします。すべての植物が植え直されたら、平均気温が摂氏27度の密閉された暗い環境に一晩置きます。
カーネルに寄生させるには、QPDAのプレート上でフザリウム・オキシスポラム・ニベウム株を単離培養して、その増殖がプレートの半分を覆うところまで接種剤を調製する。200グラムのカーネルを含む1リットルのガラス三角フラスコに滅菌水道水を加えてカーネルを準備し、少なくとも5センチメートルまでの穀物を完全に覆う。カーネルをフラスコに摂氏24度で2時間浸した後、フラスコから水を排出し、チーズクロスで包まれた綿ロールでフラスコの開口部を塞いでから、開口部をアルミホイルラップで覆います。
オートクレーブ内のフラスコを重力サイクルで1時間、乾燥時間5分で滅菌し、フラスコを室温まで冷却します。フィルター付きのキノコ栽培袋に穀物を移します。袋から空気を取り除き、余分なプラスチックを袋の周りに折りたたみます。
バッグをプラスチック製のオートクレーブセーフビンに入れ、アルミホイルラップでビンを覆ってから、以前と同じ設定で再度オートクレーブします。オートクレーブ処理後、真菌がバッグ内のカーネル上で3週間インキュベートするのを許します。4番サイズの滅菌コルクボアを使用して、培養プレート上の活発な成長ゾーンから直径6ミリメートルの寒天ディスクを切断する。
バッグを広げて、厳格な滅菌技術で5枚の寒天ディスクを配置します。滅菌50ミリリットルのメスシリンダーを使用して、35ミリリットルの滅菌水道水を測定し、バッグに加えます。プラスチックポットにポッティングミックスを充填し、測定された量のポッティングミックスを14粒の寄生カーネルを含む大きなビニール袋に加えます。
袋の中にエアクッションを作り、袋を数回反転させてカーネルと土を混ぜる前に密封します。完了したら、表面滅菌ポットに蔓延した土壌混合物を入れます。残りのスイカ品種ごとにこのプロセスを繰り返し、試験する分離株ごとに合計4つのフルポットの寄生土壌を作ります。
次に、種子の頂点端を上に向けて鉢に6個のスイカの種を蒔きます。スプレーボトルを使用して、上部の0.3〜0.6センチメートルの土壌を水で濡らしてから、透明なプラスチック製の皿を各ポットの下と上に置きます。48セルインサートに蒸気低温殺菌砂、泥炭、バーミキュライトを4:1:1の比率で充填し、インサートをタップして土壌を圧縮します。
次に、プラスチック製のトレイにインサートを置き、前述のように種をまきます。植え付けの7日前に、5枚のQPDAプレートに浸潤紙を接種し、14時間/10時間の暗所サイクルで8日間インキュベートされた領域に保管する。7日目に、100ミリリットルのジャガイモデキストロースを含む各250ミリリットルの三角フラスコに2つの1平方センチメートル寒天プラグを移し、三角フラスコをベンチトップシェーカーに置きます。
接種日に、4層の滅菌チーズクロスを通して接種物を濾過することによって胞子を収穫し、フラスコのマイクロ分生子濃度を決定した。播種後14日後、苗の入ったセルインサートをウェッブトレイに移し、次に苗の入ったウェッブトレイを7リットルの接種剤懸濁液を含むプラスチック浴槽に入れる。接種物を乱さないように15分後、接種した苗を含むセルインサートを穴のないトレイに移し、穴のないトレイを温室ベンチに置き、必要に応じて散水する。
ルートディップバイオアッセイについて前述したように、照明および環境条件を維持する。使用する方法に応じて、しおれや植物の死の発生率を観察および計算して評価を開始し、デジタル画像を撮影して病気の進行を記録します。改変トレイディップ法では、レース2分離株に感染したブラックダイヤモンド及びチャールストングレイ品種が重篤な症状を示して死亡した。
これに対し、シトルラス・アマルスPI品種は抵抗性を示した。ルートディップ法では、レース0分離株に感染した苗木はほとんど生存したが、人種-3分離株に感染したほぼすべての苗木は死亡した。寄生カーネル法では、人種2が蔓延した土壌で栽培されたシュガーベイビーとチャールストングレイの品種はしおれて枯れ始めていますが、シトルラスアマルスPI植物はまだ健康に見えます。
植物を適切に播種して維持し、病原体分離の生存率をチェックし、各接種方法の独自の技術を理解し、病気の症状を評価する際に一貫していることを忘れないでください。これらの方法の結果により、研究者は、シーケンシングおよび比較ゲノミクス解析を通じて、分離株間の差異発現を支配する根底にある遺伝的決定要因を調査することができます。これらの方法を使用して、研究者は、異なる場所にわたる異なる病原性表現型の有病率を評価し、これらの表現型を観察可能な遺伝的要素と比較することができた。
