이 프로토콜은 수박 공동체에 관련된 사람들이 fusarium wilt 병원체를 평가하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 존재하는 병원균 집단을 결정하고 효과적으로 관리하는 데 도움이됩니다. 레이스 타이핑 fusarium wilt는 완료하는 데 복잡하고 시간이 많이 걸리며, 세 가지 실행 가능한 레이스 타이핑 생물 분석 옵션을 사용하면 사용자가 실험 조건에 가장 적합한 방법을 선택할 수 있습니다. 세 가지 방법 모두 식물 건강 종사자가 특정 분리 물과 관련된 fusarium wilt 감염의 잠재적 인 중증도를 진단하는 데 도움이됩니다.
이 정보는 정보에 입각하고 효과적인 통합 질병 관리 결정을 가능하게 합니다. 심기 준비를 시작하려면 8x16 세포를 심기 배지로 채우고 토양을 압축하기 위해 아래로 두드리십시오. 그런 다음 정점이 길이와 동일한 깊이를 위쪽으로 향하게하는 씨앗을 뿌리십시오.
씨앗이 뿌려진 후, 묻힌 씨앗이 들어있는 배지를 풀러의 흙으로 0.3175 ~ 0.635 센티미터의 깊이로 덮은 다음 평지를 안개로 만들어 서있는 물이나 풀링을 만들지 않고 배지를 감쇠시킵니다. 그 후, 종자가 발아할 때까지 오일일 동안 매 180분마다 20초씩 미스트하여 배지를 촉촉하게 유지한다. 발아 후, 하루에 한 번 아파트에 물을주십시오.
5일 식재 후, 바람직한 푸사리움 옥시스포럼을 함유하는 직경 1 내지 1.25cm의 침윤된 종이 디스크를 1개의 명확히 된 V8 주스 배지 및 1/4 강도 감자 덱스트로스 한천 또는 QPDA 배지 플레이트 상에 놓고, 이들을 8일 동안 섭씨 28도의 인큐베이터에 저장한다. 여덟 번째 날에, V8 및 QPDA 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 배지 표면을 가로 질러 멸균 세포 스프레더를 긁어 내고 액체 코니디아 현탁액을 멸균 50 밀리리터 배양 튜브에 풀링하여 코니디아를 분해하십시오. 다음으로, 포자 수를 정량화하고 약 1백만 포자의 계산된 부피를 신선한 멸균 배양 튜브로 옮기고 멸균 탈이온수로 총 부피를 30 밀리리터로 가져와 최종 접종액을 준비한다.
예방 접종을 준비하려면 이전에 10 % 표백제로 소독 한 6x12 세포 스티로폼 플랫을 놓고 잘 헹구어 접종 된 식물을 섭취하십시오. 접종하기 몇 시간 전에 식물에 철저히 물을 공급하십시오. 물을 뿌린 후 두 시간 후에 8x16 세포 스티로폼 플랫에서 플랜틀릿을 제거하고 뿌리를 헹구십시오.
그런 다음 헹군 식물을 사용할 때까지 수돗물로 깨끗한 용기에 임시로 보관하여 품종을 서로 분리하십시오. 나중에 재배지를 여섯 명으로 구성된 그룹으로 분리하고 묘목 그룹을 실험실 트레이에 젖은 종이 타월로 싸서 보관하십시오. 6x12 어레이 스티로폼 트레이의 각 셀 바닥에 25 ~ 30 입방 센티미터의 토양을 놓고 스쿼트 병을 사용하여 눈에 띄게 습기가 생길 때까지 토양을 적시십시오.
건강한 방제부터 시작하여 동일한 재배자의 손상되지 않은 여섯 묘목 그룹을 접종물이 들어있는 50 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 접종하기 위해, 뿌리가 30 초 동안 잠겨있는 식물의 튜브를 와류하십시오. 다음으로, 트레이의 한 열에 동일한 재배지의 식물이있는 6x12 스티로폼 플랫에 세포 당 하나의 플랜틀릿을 놓습니다.
심는 매체로 플랜틀릿을 덮고 부드럽게 설정하십시오. 주사기를 사용하여 튀는 것을 피하면서 20 밀리리터의 물로 플랜틀릿을 적시십시오. 모든 플랜틀릿을 재식재했을 때, 평균 기온이 섭씨 27도인 밀폐된 어두운 환경에서 하룻밤 사이에 플랜틀릿을 놓으십시오.
커널을 주입하기 위해, QPDA의 플레이트 상에 fusarium oxysporum niveum 균주를 단리하고 배양하여 그 성장이 플레이트의 절반을 덮을 때까지 접종물을 준비한다. 200 그램의 커널이 들어있는 한 리터 유리 삼각 플라스크에 멸균 수돗물을 첨가하여 커널을 준비하여 곡물을 적어도 다섯 센티미터까지 완전히 덮으십시오. 커널을 섭씨 24도에서 플라스크에 두 시간 동안 담근 후 플라스크에서 물을 배수하고 플라스크의 개구부를 치즈 천으로 싸서 개구부를 막은 다음 알루미늄 호일 랩으로 개구부를 덮습니다.
중력주기로 오토클레이브의 플라스크를 다섯 분의 건조 시간으로 한 시간 동안 살균 한 다음 플라스크를 실온으로 식히십시오. 곡물을 필터가있는 버섯 재배 가방으로 옮기십시오. 가방에서 공기를 제거한 다음 여분의 플라스틱을 접으십시오.
가방을 플라스틱 오토클레이브 안전 빈에 넣고 빈을 알루미늄 호일 랩으로 덮은 다음 이전과 동일한 설정을 사용하여 다시 오토클레이브하십시오. 오토클레이빙 후, 곰팡이가 가방의 커널에서 삼 주 동안 배양되도록하십시오. 네 번째 크기의 멸균 코르크 보어를 사용하여 배양 플레이트 상의 활성 성장 구역으로부터 직경 여섯 밀리미터의 한천 디스크를 절단한다.
가방을 펼쳐 엄격한 멸균 기술로 다섯 개의 한천 디스크를 놓습니다. 멸균 된 50 밀리리터 눈금 실린더를 사용하여 35 밀리리터의 멸균 수돗물을 측정하고 가방에 첨가하십시오. 플라스틱 냄비에 포팅 믹스를 채우고 측정 된 양의 포팅 믹스를 감염된 커널 14 알갱이가 들어있는 대형 비닐 봉지에 넣으십시오.
가방에 에어 쿠션을 만들고 가방을 여러 번 뒤집어 커널과 토양을 혼합하기 전에 닫은 밀봉하십시오. 완료되면 표면 살균 된 냄비에 감염된 토양 혼합물을 채 웁니다. 시험중인 격리 된 토양 당 감염된 토양의 총 네 개의 전체 냄비에 대해 남아있는 각 수박 품종에 대해 과정을 반복하십시오.
다음으로, 씨앗의 정점 끝이 위로 향하게하여 냄비에 여섯 개의 수박 씨앗을 뿌립니다. 스프레이 병을 사용하여 0.3 ~ 0.6 센티미터의 토양 상부를 물로 적신 다음 각 냄비 아래 및 위에 투명한 플라스틱 접시를 놓습니다. 48 셀 인서트를 증기 저온 살균 모래, 이탄, 질석을 4 : 1 : 1의 비율로 채우고 인서트를 탭하여 토양을 압축하십시오.
그런 다음 플라스틱 트레이에 삽입물을 놓고 앞에서 설명한대로 씨앗을 뿌리십시오. 심기 7일 전에, 다섯 개의 QPDA 플레이트에 침윤된 종이를 접종하여 14시간/10시간 암주기로 8일 동안 배양된 지역에 보관한다. 일곱째 날에는 100 밀리리터의 감자 덱스트로스가 들어있는 각 250 밀리리터 삼각 플라스크에 1 평방 센티미터의 한천 플러그를 옮기고 삼각 플라스크를 벤치 탑 쉐이커에 놓습니다.
접종 당일에, 접종물을 네 층의 멸균 치즈 천을 통해 여과하여 포자를 수확하여 플라스크의 미세침엽수 농도를 결정한다. 파종 후 14 일 후, 묘목이있는 세포 삽입물을 웹베드 트레이로 옮긴 다음 묘목이있는 웨브 베드 트레이를 일곱 리터의 접종 현탁액이 들어있는 플라스틱 욕조에 넣으십시오. 접종물을 방해받지 않고 15 분 동안 유지 한 후, 접종 된 묘목이 들어있는 세포 삽입물을 구멍이없는 트레이로 옮기고 구멍이없는 트레이를 온실 벤치에 놓은 다음 필요에 따라 물을 뿌립니다.
뿌리딥 생물검정을 위해 앞서 설명한 바와 같이 조명 및 환경 조건을 유지한다. 사용 된 방법에 따라 시들음과 식물 사망의 발생률을 관찰 및 계산하여 등급을 시작하고 디지털 이미지를 촬영하여 질병 진행을 문서화하십시오. 변형된 트레이 딥 방법에서, 레이스-2 분리물에 감염된 블랙 다이아몬드 및 찰스턴 그레이 품종은 심각한 증상을 보였고 사망했다.
대조적으로, 시트룰루스 아마루스 PI 재배자는 저항을 보였다. 뿌리 딥 방법에서, 인종 -0 격리에 감염된 묘목은 대부분 생존했으며, 인종 -3 격리물에 감염된 거의 모든 묘목은 사망했습니다. 감염된 커널 방법에서, 인종 -2에 감염된 토양에서 자란 슈가 베이비 (Sugar Baby)와 찰스턴 그레이 (Charleston Gray) 품종은 시들고 죽기 시작했으며, 시트룰루스 아마루스 PI 식물은 여전히 건강하게 보입니다.
식물을 적절하게 파종하고 유지하고, 병원균이 생존력을 확인하고, 각 접종 방법의 고유 한 기술을 이해하고, 질병 증상을 평가할 때 일관성을 유지하는 것을 잊지 마십시오. 이러한 방법의 결과를 통해 연구자들은 시퀀싱 및 비교 유전체학 분석을 통해 분리 물 간의 차등 분산 발현을 관리하는 근본적인 유전 결정 인자를 조사 할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하여 연구자들은 서로 다른 위치에 걸쳐 다양한 독성 표현형의 유병률을 평가하고 이러한 표현형을 관찰 가능한 유전 요소와 비교할 수있었습니다.
