Bu protokol, karpuz topluluğuna katılanların fusarium solgunluk patojenini değerlendirmelerine yardımcı olabilir ve bu, mevcut patojen popülasyonlarını belirlemeye ve etkili bir şekilde yönetmeye yardımcı olacaktır. Irk tipleme fusarium solgunluğu karmaşık ve tamamlanması zaman alıcıdır ve üç uygun yarış yazma biyotahlil seçeneğine sahip olmak, kullanıcıların deneysel koşullarına en uygun yöntemi seçmelerine izin verecektir. Her üç yöntem de bitki sağlığı pratisyenlerinin belirli bir izolatla ilgili fusarium solgunluk enfeksiyonlarının potansiyel şiddetini teşhis etmelerine yardımcı olur.
Bu bilgiler, bilinçli ve etkili entegre hastalık yönetimi kararları alınmasını sağlar. Dikim hazırlığına başlamak için, toprağı sıkıştırmak için aşağı dokunurken 8x16 hücre başlangıç düzlüklerini ekim ortamıyla doldurun. Ardından, tepeleri yukarı doğru uzunluklarına eşit bir derinliğe işaret eden tohumları ekin.
Tohumlar ekildikten sonra, gömülü tohumları içeren ortamı Fuller'ın toprağı ile 0.3175 ila 0.635 santimetre derinliğe kadar örtün ve ardından ayakta durma veya biriken su oluşturmadan ortamı nemlendirmek için daireleri buğulayın. Daha sonra, tohum çimlenmesine kadar beş gün boyunca her 180 dakikada bir 20 saniye buğulanarak ortamı nemli tutun. Çimlenmeden sonra, daireleri günde bir kez sulayın.
Ekimden beş gün sonra, tercih edilen fusarium oxysporum izolatını içeren 1 ila 1.25 santimetre çapında sızmış kağıt diskleri, sekiz gün boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatörde saklamak için bir berraklaştırılmış V8 meyve suyu ortamı ve 1/4 mukavemetli patates dekstroz agar veya QPDA medya plakası üzerine yerleştirin. Sekizinci günde, V8 ve QPDA plakalarını, orta yüzey boyunca steril bir hücre yayıcıyı kazıyarak ve sıvı konidia süspansiyonunu steril 50 mililitrelik bir kültür tüpüne havuzlayarak konidiayı yerinden çıkarmadan önce bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Daha sonra, spor sayılarını ölçün ve yaklaşık 1 milyon sporun hesaplanan hacmini taze steril kültür tüpüne aktararak ve toplam hacmi steril deiyonize su ile 30 mililitreye getirerek nihai inokülum çözeltisini hazırlayın.
Aşılamaya hazırlanmak için, daha önce% 10 ağartıcı ile sterilize edilmiş ve aşılanmış bitkileri almak için iyice durulanmış 6x12 hücreli strafor düzlükleri yerleştirin. Aşılamadan birkaç saat önce, bitkileri iyice sulayın. Sulamadan iki saat sonra, plantletleri 8x16 hücreli strafor düzlüklerinden çıkarın ve köklerini durulayın.
Daha sonra, durulanmış bitkileri geçici olarak kullanıma kadar musluk suyuyla temiz kaplarda saklayın ve çeşitleri birbirinden ayrı tutun. Daha sonra, plantletleri altı kişilik gruplara ayırın ve fide gruplarını bir laboratuvar tepsisinde ıslak kağıt havlulara sarılı tutun. 6x12 dizili strafor tepsisinin her hücresinin dibine 25 ila 30 santimetreküp toprak yerleştirin ve toprağı gözle görülür şekilde nemli olana kadar ıslatmak için bir fışkırtma şişesi kullanın.
Sağlıklı kontrolden başlayarak, aynı çeşidin hasarsız altı fidesinden oluşan bir grubu, inokulumu içeren 50 mililitrelik tüplere yerleştirin. Aşılamak için, kökleri 30 saniye boyunca suya batırılmış plantlet tüplerini vorteksleyin. Daha sonra, tepsinin bir sütununda aynı çeşidin bitkileriyle 6x12 strafor düzlüklerine hücre başına tek bir plantlet yerleştirin.
Plantletleri dikim ortamıyla örtün ve yavaşça ayarlayın. Sıçramayı önlerken plantleti 20 mililitre suyla ıslatmak için bir şırınga kullanın. Tüm plantletler yeniden ekildiğinde, plantletleri gece boyunca ortalama 27 santigrat derece sıcaklığa sahip kapalı karanlık bir ortama yerleştirin.
Çekirdekleri enfekte etmek için, bir QPDA plakası üzerindeki bir fusarium oxysporum niveum suşunu izole ederek ve kültüre alarak, büyümesinin plakanın yarısını kapladığı noktaya kadar inokulum hazırlayın. En az beş santimetreye kadar taneleri tamamen örtmek için 200 gram çekirdek içeren bir litrelik cam Erlenmeyer şişelerine steril musluk suyu ekleyerek çekirdekleri hazırlayın. Çekirdekleri şişelerde iki saat boyunca 24 santigrat derecede beklettikten sonra, şişedeki suyu boşaltın ve açıklığı alüminyum folyo sargı ile kaplamadan önce şişenin açıklığını peynir bezine sarılmış bir parça pamuklu rulo ile tıkayın.
Otoklavdaki şişeleri bir yerçekimi döngüsünde beş dakikalık kuruma süresiyle bir saat boyunca sterilize edin, ardından şişelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Tahılları bir filtreyle mantar yetiştirme torbasına aktarın. Havayı torbadan çıkarın ve ardından fazla plastiği etrafına katlayın.
Torbayı plastik otoklev güvenli bir kutuya yerleştirin ve kutuyu alüminyum folyo sargı ile örtün, ardından daha önce olduğu gibi aynı ayarları kullanarak tekrar otoklav yapın. Otoklavlamadan sonra, mantarın üç hafta boyunca torbadaki çekirdekler üzerinde kuluçkaya yatmasına izin verin. Agar disklerini kültür plakasındaki aktif büyüme bölgesinden altı milimetre çapında kesmek için dört numaralı steril bir mantar deliği kullanın.
Sıkı bir steril teknikle beş agar diski yerleştirmek için torbayı açın. Torbaya 35 mililitre steril musluk suyunu ölçmek ve eklemek için steril 50 mililitrelik dereceli bir silindir kullanın. Plastik bir tencereyi bir saksı karışımı ile doldurun ve ardından ölçülen miktarda saksı karışımını 14 tane istila edilmiş çekirdek içeren büyük bir plastik torbaya ekleyin.
Torbada bir hava yastığı oluşturun ve torbayı birkaç kez ters çevirerek çekirdekleri ve toprağı karıştırmadan önce kapatın. Bir kez bittiğinde, yüzey sterilize edilmiş bir tencereyi istila edilmiş toprak karışımı ile doldurun. Test edilen izolat başına toplam dört tam istila edilmiş toprak kabı için kalan her karpuz çeşidi için işlemi tekrarlayın.
Daha sonra, tohumun tepe ucu yukarı bakacak şekilde tencereye altı karpuz tohumu ekin. Bir sprey şişesi kullanarak, üst 0,3 ila 0,6 santimetre toprağı suyla ıslatın ve ardından her kabın altına ve üzerine şeffaf bir plastik tabak yerleştirin. 48 hücre ekini buharla pastörize kum, turba, vermikülit ile 4: 1: 1 oranında doldurun ve toprağı sıkıştırmak için eklere dokunun.
Ardından, ekleri plastik tepsilere yerleştirin ve tohumları daha önce açıklandığı gibi ekin. Ekimden yedi gün önce, beş QPDA plakasını sızmış kağıtla aşılayın ve 14 saat / 10 saatlik karanlık bir döngüde sekiz gün boyunca inkübe edilmiş bir alanda saklayın. Yedinci günde, 100 mililitre patates dekstrozu içeren her 250 mililitrelik Erlenmeyer şişesine iki adet bir santimetrekarelik agar fişi aktarın ve Erlenmeyer şişelerini bir tezgah üstü çalkalayıcıya yerleştirin.
Aşılama gününde, şişenin mikro-konidiyal konsantrasyonunu belirlemek için inokulumu dört kat steril peynir bezinden filtreleyerek sporları hasat edin. Ekimden 14 gün sonra, fidelerle birlikte hücre eklerini perdeli tepsiye aktarın, ardından perdeli tepsiyi fidelerle birlikte yedi litre inokulum süspansiyonu içeren plastik bir küvete yerleştirin. İnokulumu rahatsız etmeden 15 dakika tuttuktan sonra, aşılanmış fideleri içeren hücre eklerini deliksiz tepsilere aktarın ve deliksiz tepsileri sera tezgahına yerleştirin, ardından gerektiğinde sulayın.
Kök daldırma biyotahlili için daha önce açıklandığı gibi aydınlatma ve çevre koşullarını koruyun. Kullanılan yönteme bağlı olarak, solgunluk ve bitki ölümü insidansını gözlemleyerek ve hesaplayarak derecelendirmeye başlayın ve hastalığın ilerlemesini belgelemek için dijital görüntüler alın. Modifiye tepsi daldırma yönteminde, bir ırk-2 izolatı ile enfekte olmuş Black Diamond ve Charleston Gray çeşitleri ciddi semptomlar gösterdi ve öldü.
Buna karşılık, Citrullus amarus PI çeşidi direnç gösterdi. Kök daldırma yönteminde, bir ırk-0 izolatı ile enfekte olmuş fideler çoğunlukla hayatta kalırken, bir ırk-3 izolatı ile enfekte olmuş neredeyse tüm fideler öldü. İnfeste çekirdek yönteminde, ırk-2 istilasına uğramış toprakta yetişen Sugar Baby ve Charleston Gray çeşitleri solmaya ve ölmeye başlarken, Citrullus amarus PI bitkileri hala sağlıklı görünmektedir.
Bitkileri uygun şekilde ekmeyi ve sürdürmeyi, patojen izolatını canlılık açısından kontrol etmeyi, her aşılama yönteminin benzersiz tekniklerini anlamayı ve hastalık semptomlarını değerlendirirken tutarlı olmayı unutmayın. Bu yöntemlerin sonuçları ile araştırmacılar, dizileme ve karşılaştırmalı genomik analiz yoluyla izolatlar arasındaki diferansiyel varyans ekspresyonunu yöneten altta yatan genetik determinantları araştırabilirler. Bu yöntemleri kullanarak, araştırmacılar farklı virülans fenotiplerinin farklı yerlerdeki prevalansını değerlendirebildiler ve bu fenotipleri gözlemlenebilir genetik elementlerle karşılaştırabildiler.
