يوضح البروتوكول كيفية إجراء الفحص المجهري ثلاثي الفوتون في الأنسجة العميقة في الجسم الحي في دماغ الفأر والزرد البالغ. نظامان نموذجيان مهمان في علوم الحياة. يتيح الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات طويل الطول الموجي التصوير المكاني عالي الدقة للأنسجة أو الأعضاء السليمة في أعماق لا يمكن الوصول إليها بواسطة المجهر ثنائي الفوتون.
يمكن أن تساعدنا هذه التقنية على فهم الآليات الكامنة وراء الأمراض العصبية ، مثل مرض الزهايمر والتوحد ، حيث لا يوجد فهم كامل لكيفية تأثير المرض على الدماغ. سيتم عرض إجراء تصوير دماغ الفأر Kibaek Choe ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبرنا وإظهار إجراء تصوير دماغ الزرد سيكون كريستين كولكمان ، وهي باحثة مشاركة من مختبر أبحاث Fetcho. للبدء ، قم بتشغيل الليزر واضبط الطول الموجي المركزي لخرج الخمول للمضخم البصري البارامتري غير الخطي على 1،300 أو 1،700 نانومتر ، ثم ضع ضواغط النبض على مسار الضوء لتغريد ليزر الفيمتو ثانية مسبقا وتحسين مدة النبض للتصوير ثلاثي الفوتونات.
اضبط الزاوية بين صفيحة السيليكون ومسار الليزر بزاوية بروستر لزيادة نفاذية الليزر إلى أقصى حد ، ثم قم بتدوير صفيحة السيليكون لتحقيق زاوية بروستر عن طريق تقليل الانعكاس. بعد ذلك ، ضع مرايا الزعانف للتبديل بسهولة بين خطوط شعاع 1،300 و 1 ، 700 نانومتر. ضع صفيحة موجية نصف مثبتة على مرحلة دوران ومقسم شعاع استقطاب للتحكم في شدة الليزر ، ثم ضع مانع شعاع في مسار انعكاس مقسم الشعاع.
تحضير طبق بتري مع 0.5 سم من 2٪ من أجار درجة الانصهار العالية 2٪. بمجرد أن يبرد الأجار ويتصلب ، قم بقطع ثقب مستطيل في الآجار لفترة أطول وأوسع قليلا من الأسماك. باستخدام الشمع ، قم بتوصيل أنابيب رقيقة بطبق Petri مع نهاية واحدة في المستطيل وأنبوب أكبر قطرا على حافة طبق Petri.
بعد ذلك ، قم بتخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول تريكاين 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر ، ثم ضع السمكة المخدرة على جانبها على إسفنجة رطبة ، ثم باستخدام حقنة دقيقة ، حقن 3 ميكرولترات من بروميد الباكورونيوم في المدار الرجعي لشل الأسماك ووضعها لفترة وجيزة في محلول هانك لضمان شلولها بالكامل. بعد ذلك ، ضع الجانب الظهري للسمك في طبق بتري مع الرأس نحو الأنابيب ، ثم باستخدام الملقط ، افتح فم السمكة بلطف وحرك الأنبوب في الفم. حرك السمكة برفق نحو الأنابيب بحيث تكون الأنابيب في الجزء الخلفي من فم السمكة.
بسرعة ، ولكن بلطف ، قم بتجفيف الآجار حول الأسماك وإزالة الماء فوق السمكة. اغمس قطعة صغيرة من أنسجة المختبر في غراء المختبر وضع الأنسجة على الآجار على جانبي السمكة وفوق ظهر السمكة الذيلية إلى الخياشيم. بعد ذلك ، قم بتخدير جلد السمكة عن طريق وضع قطرة صغيرة من بوبيفاكايين مباشرة على سطح الرأس ، ثم أحضر طبق بتري مع السمك إلى المجهر.
املأ الطبق بمياه مرفق الأسماك وقم بتوصيله بالأنابيب إلى مضخة مياه لضخ مياه النظام في فم السمكة. تأكد من أكسجة الماء باستخدام فقاعة وتسخينه إلى 30 درجة مئوية باستخدام سخان حوض السمك. للتصوير ، ضع هدفا منخفض التكبير على المجهر ثلاثي الفوتون ، ثم ضع طبق بتري الذي يحتوي على الأسماك والأنابيب تحت المجهر واستخدم مصدر ضوء LED لإضاءة طبق بتري.
من برنامج الحصول على الصور، افتح وضع الكاميرا، وانقر على لايف، واختر القناة A على الجانب الأيمن من الشاشة واضبط إعدادات الرسم البياني لرؤية الصورة بوضوح. بعد ضبط إعداد المحرك على وحدة التحكم في المحرك إلى القاعدة ، اخفض الهدف حتى تصبح الأسماك مرئية. ضع مركز رأس السمكة في وسط مجال الرؤية ، ثم حرك الهدف لأعلى وبعيدا عن رأس السمكة.
استبدل العدسة الموضوعية منخفضة التكبير بالعدسة الموضوعية ذات الفتحة العددية العالية للتصوير ثلاثي الفوتونات، ثم حركها بالقرب من رأس السمكة. اضبط قيم المحاور لجميع المحركات على الصفر. اخفض العدسة الموضوعية ببطء ، مما يضمن عدم اتصال الهدف بالرأس جسديا.
في برنامج كاميرا CCD ، توقف عن تحريك الهدف عندما يكون الجزء العلوي من الرأس مرئيا واضبط مواقع X و Y و Z على الصفر. أطفئ مصدر ضوء LED وأغلق الستارة المظلمة حول النظام ، ثم اضبط برنامج الحصول على التصوير على وضع GG متعدد الفوتونات للتصوير ثلاثي الفوتونات واضبط الطاقة تحت العدسة الموضوعية على أقل من مللي واط واحد. انقر على زر Live في برنامج الحصول على الصور.
افتح قنوات PMT واضبط مستوى اكتساب PMT والخلفية حسب الحاجة. حرك ببطء العدسة الموضوعية لتحديد موقع سطح الرأس عن طريق مراقبة قناة THG من الأوعية الدموية الكبيرة وسطح زجاج النافذة. بعد تحريك عدسة الهدف بالقرب من النافذة ، ضع الماء بين الهدف ونافذة الجمجمة ، ثم اضبط قيم المحور لجميع المحركات على الصفر.
انقر على زر Live في برنامج الحصول على الصور. افتح قنوات PMT واضبط مستوى كسب PMT والخلفية حسب الحاجة ، ثم حرك ببطء العدسة الموضوعية لتحديد موقع سطح انزلاق الغطاء عن طريق مراقبة قناة THG من الأوعية الدموية الكبيرة وسطح زجاج النافذة. اضبط اتجاه النافذة إذا لزم الأمر ، ثم صفر المحركات لتحديد سطح الدماغ.
قم بإجراء التصوير وضبط مستوى الطاقة وفقا لعمق التصوير. يتم تحقيق تصوير عالي الدقة وغير غازي وعميق للخلايا العصبية ذات العلامات الوراثية في دماغ الزرد البالغ باستخدام المجهر ثلاثي الفوتونات. يمكن أيضا ملاحظة توزيع طبقات الخلايا في التكتوم البصري والمخيخ.
تم استخدام ميزة الكاميرا في المجهر لتحديد موقع الأسماك. وينظر إلى الجمجمة في قناة THG ، مما يساعد على التنقل في الدماغ والعثور على السطح العلوي. يمكن تمييز الخلايا العصبية بنسبة إشارة إلى خلفية عالية في عمق دماغ البالغين.
يتم عرض صور متعددة الألوان ثلاثية الفوتونات للخلايا العصبية التي تحمل علامة GCaMP6s والأوعية الدموية ذات العلامات الحمراء في تكساس مع إشارات THG في دماغ الفأر البالغ هنا. مع تحسين الإعداد ، تم الحصول على صور عالية التباين بنجاح حتى 1.2 ملم من سطح الدماغ في منطقة الحصين CA1. أظهرت آثار نشاط الكالسيوم للخلايا العصبية الموسومة GCaMP6s على عمق 750 ميكرومتر لجلسة تسجيل مدتها 10 دقائق دقة تسجيل عالية.
يمكن أن يساعد هذا الإعداد في تصور النشاط العصبي لفهم وظائف الدماغ. ويمكن أيضا أن تستخدم لتتبع حركة الخلايا داخل الأنسجة البيولوجية لفهم النظم البيولوجية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا قياس سرعة تدفق الدم لمراقبة صحة الحيوان.
