Protokol, fare beyninde ve yetişkin zebra balıklarında in vivo derin doku üç foton mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Yaşam bilimlerinde iki önemli model sistem. Uzun dalga boylu üç foton mikroskopisi, iki foton mikroskobu ile erişilemeyen derinliklerde bozulmamış dokuların veya organların in vivo yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.
Bu teknik, hastalığın beyni nasıl etkilediğine dair tam bir anlayışın eksik olduğu Alzheimer ve otizm gibi nörolojik hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir. Fare beyin görüntüleme prosedürünü gösteren, laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı Kibaek Choe ve zebra balığı beyin görüntüleme prosedürünü gösteren, Fetcho Araştırma Laboratuvarı'ndan bir araştırma görevlisi olan Kristine Kolkman olacaktır. Başlamak için, lazeri açın ve kollineer olmayan optik parametrik amplifikatörün avara çıkışının merkez dalga boyunu 1, 300 veya 1.700 nanometreye ayarlayın, ardından femtosaniye lazeri önceden cıvıldamak ve üç fotonlu görüntüleme için darbe süresini optimize etmek için darbe kompresörlerini ışık yoluna yerleştirin.
Lazer geçirgenliğini en üst düzeye çıkarmak için silikon plaka ve lazer yolu arasındaki açıyı Brewster'ın açısında ayarlayın, ardından yansımayı en aza indirerek Brewster'ın açısını elde etmek için silikon plakayı döndürün. Ardından, 1.300 ve 1.700 nanometre ışın hatları arasında rahatça geçiş yapmak için paletli aynalar yerleştirin. Lazerin yoğunluğunu kontrol etmek için bir dönme aşamasına monte edilmiş yarım dalga plakası ve polarize edici bir ışın ayırıcı yerleştirin, ardından ışın ayırıcının yansıma yoluna bir ışın engelleyici yerleştirin.
0,5 santimetre% 2 yüksek erime noktası agar ile bir Petri kabı hazırlayın. Agar soğuduktan ve katılaştıktan sonra, agarda balıktan daha uzun ve biraz daha geniş dikdörtgen bir delik açın. Balmumu kullanarak, Petri kabına ince bir boruyu, dikdörtgende bir ucu ve Petri kabının kenarına daha büyük çaplı bir boru ile takın.
Daha sonra, balığı mililitre trikain çözeltisi başına 0.2 miligramlık bir çözeltiye yerleştirerek anestezi yapın, daha sonra anestezi altındaki balığı ıslak bir sünger üzerine yan tarafına yerleştirin, daha sonra bir mikroşırınga kullanarak, balığı felç etmek için retro-orbital olarak 3 mikrolitre pankuronyum bromür enjekte edin ve tamamen felç olmasını sağlamak için kısaca Hank'in çözeltisine yerleştirin. Daha sonra, balığın sırt tarafını Petri kabına yukarı doğru yerleştirin, ardından forseps kullanarak, balığın ağzını yavaşça açın ve tüpü ağzına kaydırın. Balıkları yavaşça boruya doğru kaydırın, böylece boru balığın ağzının arkasında olacaktır.
Hızlıca, ama nazikçe, agar'ı balığın etrafında kurutun ve balığın üstündeki suyu çıkarın. Küçük bir laboratuvar dokusu parçasını laboratuvar yapıştırıcısına batırın ve dokuyu balığın her iki tarafındaki agarın üzerine ve balığın sırt kaudalinin üzerinden solungaçlara koyun. Daha sonra, doğrudan başın yüzeyine küçük bir damla bupivakain yerleştirerek balığın derisini uyuşturun, ardından Petri kabını balıkla birlikte mikroskopa getirin.
Kabı balık tesisi suyuyla doldurun ve sistem suyunu balığın ağzına pompalamak için boruya bir su pompasına bağlayın. Suyun bir kabarcıkla oksijenlendiğinden ve bir akvaryum ısıtıcısıyla 30 santigrat dereceye kadar ısıtıldığından emin olun. Görüntüleme için, üç fotonlu mikroskopa düşük büyütmeli bir hedef yerleştirin, ardından balıkları ve tüpleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin ve Petri kabını aydınlatmak için bir LED ışık kaynağı kullanın.
Görüntü alma yazılımından Kamera modunu açın, Canlı'yı tıklayın, ekranın sağ tarafındaki A kanalını seçin ve görüntüyü net bir şekilde görmek için histogram ayarlarını yapın. Motor kontrolöründeki motor ayarını tabana ayarladıktan sonra, balık görünene kadar hedefi düşürün. Balık kafasının merkezini görüş alanının merkezine yerleştirin, ardından hedefi balığın kafasından yukarı ve uzağa hareket ettirin.
Düşük büyütmeli objektif lensi, üç fotonlu görüntüleme için yüksek sayısal diyaframlı objektif lensle değiştirin, ardından balığın kafasına doğru yaklaştırın. Tüm motorların eksen değerlerini sıfıra ayarlayın. Objektif lensi yavaşça alçaltın, objektifin kafaya fiziksel olarak temas etmemesini sağlayın.
CCD kamera yazılımında, başın üst kısmı göründüğünde hedefi hareket ettirmeyi bırakın ve X, Y ve Z konumlarını sıfıra ayarlayın. LED ışık kaynağını kapatın ve sistemin etrafındaki karanlık perdeyi kapatın, ardından görüntüleme alma yazılımını üç fotonlu görüntüleme için çoklu foton GG moduna ayarlayın ve objektif lensin altındaki gücü bir miliwatt'tan daha az bir değere ayarlayın. Görüntü alma yazılımındaki Canlı düğmesine tıklayın.
PMT kanallarını açın ve PMT kazancını ve arka plan seviyesini gerektiği gibi ayarlayın. THG kanalını büyük kan damarlarından ve pencere camı yüzeyinden izleyerek başın yüzeyini bulmak için objektif lensi yavaşça yukarı doğru hareket ettirin. Hedef lensi pencereye yaklaştırdıktan sonra, objektif ile kafatası penceresi arasına su uygulayın, ardından tüm motorların eksen değerlerini sıfıra ayarlayın.
Görüntü alma yazılımındaki Canlı düğmesine tıklayın. PMT kanallarını açın ve PMT kazancını ve arka plan seviyesini gerektiği gibi ayarlayın, ardından THG kanalını büyük kan damarlarından ve pencere camı yüzeyinden izleyerek kapak kaymasının yüzeyini bulmak için objektif lensi yavaşça yukarı doğru hareket ettirin. Gerekirse pencere yönünü ayarlayın, ardından beynin yüzeyini tanımlamak için motorları sıfırlayın.
Görüntüleme gerçekleştirin ve güç seviyesini görüntüleme derinliğine göre ayarlayın. Yetişkin zebra balığı beynindeki genetik olarak etiketlenmiş nöronların yüksek çözünürlüklü, invaziv olmayan ve derin görüntülemesi, üç foton mikroskobu kullanılarak elde edilir. Optik tektum ve beyincikteki hücre katmanlarının dağılımı da gözlemlenebilir.
Mikroskobun kamera özelliği balığın yerini belirlemek için kullanıldı. Kafatası, beyinde gezinmeye ve üst yüzeyi bulmaya yardımcı olan THG kanalında görülür. Nöronlar, yetişkin beyninin derinliklerinde yüksek sinyal-arka plan oranı ile ayırt edilebilir.
GCaMP6s etiketli nöronların ve Teksas Kırmızı etiketli kan damarlarının çok renkli üç foton görüntüleri, yetişkin fare beynindeki THG sinyalleri ile birlikte burada gösterilmektedir. Kurulum optimizasyonu ile, CA1 hipokampus bölgesindeki beyin yüzeyinden 1,2 milimetreye kadar yüksek kontrastlı görüntüler başarıyla elde edildi. GCaMP6s etiketli nöronların kalsiyum aktivitesi izleri, 10 dakikalık bir kayıt oturumu için 750 mikrometre derinlikte yüksek kayıt doğruluğu gösterdi.
Bu kurulum, beyin fonksiyonunu anlamak için nöronal aktiviteyi görselleştirmeye yardımcı olabilir. Çeşitli biyolojik sistemleri anlamak için biyolojik doku içindeki hücre hareketini izlemek için de kullanılabilir. Ek olarak, hayvanın sağlığını izlemek için kan akış hızı da ölçülebilir.
