O protocolo ilustra como realizar microscopia de três fótons in vivo no cérebro do camundongo e zebrafish adulto. Dois sistemas de modelos importantes em ciências da vida. Microscopia de três fótons de comprimento de onda longa permite imagens in vivo de alta resolução espacial de tecidos ou órgãos intactos em profundidades inacessíveis por microscopia de dois fótons.
Essa técnica pode nos ajudar a entender os mecanismos subjacentes de doenças neurológicas, como Alzheimer e autismo, onde falta uma compreensão completa de como a doença afeta o cérebro. Demonstrando o procedimento de imagem cerebral do camundongo estará Kibaek Choe, o pesquisador de pós-doutorado do nosso laboratório e demonstrando o procedimento de imagem cerebral de zebrafish será Kristine Kolkman, uma pesquisadora associada do Laboratório de Pesquisa Fetcho. Para começar, ligue o laser e coloque o comprimento de onda central da saída oclíctica do amplificador óptico não collinear paramétrico em 1, 300 ou 1.700 nanômetros, em seguida, coloque compressores de pulso no caminho da luz para pré-chirp o laser femtosegundo e otimize a duração do pulso para imagens de três fótons.
Defina o ângulo entre a placa de silício e o caminho laser no ângulo de Brewster para maximizar a transmissão a laser e gire a placa de silício para alcançar o ângulo de Brewster minimizando o reflexo. Em seguida, coloque espelhos de nadadeira para alternar convenientemente entre as linhas de feixe de 1.300 e 1.700 nanômetros. Coloque uma meia onda montada em um estágio de rotação e um divisor de feixe polarizador para controlar a intensidade do laser, em seguida, coloque um bloqueador de feixe no caminho de reflexão do divisor de feixes.
Prepare uma placa de Petri com 0,5 centímetros de ágar de ponto de fusão de 2%. Uma vez que o ágar tenha esfriado e solidificado, corte um orifício retangular no ágar mais longo e ligeiramente mais largo que o peixe. Usando cera, conecte tubos finos à placa de Petri com uma extremidade no retângulo e uma tubulação de maior diâmetro à borda da placa de Petri.
Em seguida, anestesiar o peixe colocando-o em uma solução de tricaine de 0,2 mililiter, em seguida, coloque o peixe anestesiado de lado em uma esponja molhada, em seguida, usando uma microsinga, retro-orbitalmente injetar 3 microliters de brometo de pancurônio para paralisar o peixe e colocá-lo brevemente na solução de Hank para garantir que ele está totalmente paralisado. Em seguida, coloque o peixe dorsal-side na placa de Petri com a cabeça em direção ao tubo, em seguida, usando fórceps, abra suavemente a boca do peixe e deslize o tubo para a boca. Deslize suavemente o peixe em direção à tubulação para que a tubulação fique na parte de trás da boca do peixe.
Rápido, mas suavemente, seque o ágar ao redor do peixe e remova a água em cima do peixe. Mergulhe um pequeno pedaço de tecido de laboratório em cola de laboratório e coloque o tecido no ágar em ambos os lados do peixe e sobre as costas do peixe caudal para as brânquias. Em seguida, anestesiar a pele do peixe colocando uma pequena gota de bupivacaína diretamente na superfície da cabeça, em seguida, leve a placa de Petri com o peixe para o microscópio.
Encha o prato com água da instalação de peixes e conecte-se à tubulação a uma bomba de água para bombear água do sistema na boca do peixe. Certifique-se de que a água é oxigenada com um borbulhante e aquecida a 30 graus Celsius com um aquecedor de aquário. Para a imagem, coloque um objetivo de baixa ampliação no microscópio de três fótons, em seguida, coloque a placa de Petri contendo o peixe e os tubos sob o microscópio e use uma fonte de luz LED para iluminar a placa de Petri.
A partir do software de aquisição de imagens, abra o modo Câmera, clique em Live, escolha o canal A no lado direito da tela e ajuste as configurações do histograma para ver a imagem claramente. Depois de definir a configuração do motor no controlador do motor para basear, abaixe o objetivo até que o peixe esteja visível. Coloque o centro da cabeça de peixe no centro do campo de visão, em seguida, mova o objetivo para cima e para longe da cabeça do peixe.
Substitua a lente objetiva de baixa ampliação pela lente objetiva de abertura numérica alta para imagens de três fótons e, em seguida, mova-a para perto da cabeça do peixe. Defina os valores do eixo de todos os motores a zero. Abaixe lentamente a lente objetiva, garantindo que o objetivo não entre em contato fisicamente com a cabeça.
No software da câmera CCD, pare de mover o objetivo quando a parte superior da cabeça estiver visível e definir os locais X, Y e Z como zero. Desligue a fonte de luz LED e feche a cortina escura ao redor do sistema, em seguida, defina o software de aquisição de imagens para o modo GG multifotol para imagens de três fótons e defina a energia sob a lente objetiva para menos de um miliwatt. Clique no botão Viver no software de aquisição de imagens.
Abra os canais PMT e ajuste o ganho pmt e o nível de fundo conforme necessário. Mova-se lentamente para cima da lente objetiva para localizar a superfície da cabeça monitorando o canal THG a partir dos grandes vasos sanguíneos e da superfície de vidro da janela. Depois de mover a lente objetiva perto da janela, aplique água entre o objetivo e a janela craniana, em seguida, defina os valores do eixo de todos os motores a zero.
Clique no botão Viver no software de aquisição de imagens. Abra os canais PMT e ajuste o ganho pmt e o nível de fundo conforme necessário, em seguida, mova-se lentamente para cima da lente objetiva para localizar a superfície do deslizamento de cobertura monitorando o canal THG a partir dos vasos sanguíneos grandes e da superfície de vidro da janela. Ajuste a orientação da janela se necessário, depois zero os motores para definir a superfície do cérebro.
Realize imagens e ajuste o nível de potência de acordo com a profundidade de imagem. Imagens de alta resolução, não invasivas e profundas de neurônios geneticamente rotulados no cérebro adulto de zebrafish são alcançadas usando microscopia de três fótons. Também é observada a distribuição de camadas celulares no tectum óptico e no cerebelo.
A câmera do microscópio foi usada para localizar o peixe. O crânio é visto no canal THG, que ajuda a navegar pelo cérebro e encontrar a superfície superior. Os neurônios são distinguíveis com uma alta relação sinal-fundo no cérebro adulto.
Imagens multicoloridas de três fótons de neurônios rotulados por GCaMP6s e vasos sanguíneos rotulados pelo Texas Red, juntamente com sinais de THG no cérebro de camundongos adultos são mostrados aqui. Com a otimização da configuração, imagens de alto contraste foram obtidas com sucesso até 1,2 milímetros da superfície cerebral na região do hipocampo ca1. Traços de atividade de cálcio de neurônios rotulados por GCaMP6s a uma profundidade de 750 micrômetros para uma sessão de gravação de 10 minutos mostraram alta fidelidade de gravação.
Essa configuração pode ajudar a visualizar a atividade neuronal para entender a função cerebral. Também pode ser usado para rastrear o movimento celular dentro do tecido biológico para entender vários sistemas biológicos. Além disso, a velocidade do fluxo sanguíneo também pode ser medida para monitorar a saúde do animal.
