El protocolo ilustra cómo realizar in vivo microscopía de tres fotones de tejido profundo en cerebro de ratón y pez cebra adulto. Dos sistemas modelo importantes en las ciencias de la vida. La microscopía de tres fotones de longitud de onda larga permite obtener imágenes in vivo de alta resolución espacial de tejidos u órganos intactos a profundidades que son inaccesibles mediante microscopía de dos fotones.
Esta técnica puede ayudarnos a comprender los mecanismos subyacentes de las enfermedades neurológicas, como el Alzheimer y el autismo, donde falta una comprensión completa de cómo la enfermedad afecta al cerebro. Demostrando el procedimiento de imágenes cerebrales de ratón estará Kibaek Choe, el investigador postdoctoral de nuestro laboratorio y demostrando el procedimiento de imágenes cerebrales del pez cebra será Kristine Kolkman, investigadora asociada del Laboratorio de Investigación Fetcho. Para comenzar, encienda el láser y establezca la longitud de onda central de la salida de ralentí del amplificador paramétrico óptico no colineal a 1, 300 o 1, 700 nanómetros, luego coloque los compresores de pulso en la trayectoria de la luz para pre-chirriar el láser de femtosegundo y optimizar la duración del pulso para imágenes de tres fotones.
Establezca el ángulo entre la placa de silicio y la trayectoria del láser en el ángulo de Brewster para maximizar la transmitancia del láser, luego gire la placa de silicio para lograr el ángulo de Brewster minimizando la reflexión. A continuación, coloque espejos de aleta para cambiar convenientemente entre las líneas de haz de 1, 300 y 1, 700 nanómetros. Coloque una media placa de onda montada en una etapa de rotación y un divisor de haz polarizador para controlar la intensidad del láser, luego coloque un bloqueador de haz en la trayectoria de reflexión del divisor de haz.
Prepare una placa de Petri con 0,5 centímetros de agar de alto punto de fusión al 2%. Una vez que el agar se haya enfriado y solidificado, corte un agujero rectangular en el agar más largo y ligeramente más ancho que el pescado. Usando cera, conecte tubos delgados a la placa de Petri con un extremo en el rectángulo y un tubo de mayor diámetro al borde de la placa de Petri.
A continuación, anestesiar el pescado colocándolo en una solución de 0,2 miligramos por mililitro de tricaína, luego colocar el pescado anestesiado de lado sobre una esponja húmeda, luego usando una microjeringa, inyectar retro-orbitalmente 3 microlitros de bromuro de pancuronio para paralizar el pez y colocarlo brevemente en la solución de Hank para asegurarse de que esté completamente paralizado. A continuación, coloque el lado dorsal del pez hacia arriba en la placa de Petri con la cabeza hacia el tubo, luego use fórceps, abra suavemente la boca del pez y deslice el tubo hacia la boca. Deslice suavemente el pez hacia el tubo para que el tubo esté en la parte posterior de la boca del pez.
Rápidamente, pero suavemente, seque el agar alrededor del pescado y retire el agua sobre el pescado. Sumerja un pequeño trozo de tejido de laboratorio en pegamento de laboratorio y coloque el tejido en el agar a ambos lados del pez y sobre la espalda del pez caudal hasta las branquias. A continuación, anestesia la piel del pez colocando una pequeña gota de bupivacaína directamente en la superficie de la cabeza, luego lleva la placa de Petri con el pescado al microscopio.
Llene el plato con agua de la instalación de peces y conéctelo al tubo a una bomba de agua para bombear agua del sistema a la boca del pez. Asegúrese de que el agua se oxigena con un burbujeador y se calienta a 30 grados centígrados con un calentador de acuario. Para obtener imágenes, coloque un objetivo de bajo aumento en el microscopio de tres fotones, luego coloque la placa de Petri que contiene el pescado y los tubos debajo del microscopio y use una fuente de luz LED para iluminar la placa de Petri.
Desde el software de adquisición de imágenes, abra el modo Cámara, haga clic en Live, elija el canal A en el lado derecho de la pantalla y ajuste la configuración del histograma para ver la imagen claramente. Después de ajustar la configuración del motor en el controlador del motor a la base, baje el objetivo hasta que el pez sea visible. Coloque el centro de la cabeza del pez en el centro del campo de visión, luego mueva el objetivo hacia arriba y lejos de la cabeza del pez.
Reemplace la lente del objetivo de bajo aumento con la lente del objetivo de alta apertura numérica para obtener imágenes de tres fotones, luego muévala cerca de la cabeza del pez. Establezca los valores de eje de todos los motores en cero. Baje lentamente la lente del objetivo, asegurándose de que el objetivo no entre en contacto físico con la cabeza.
En el software de la cámara CCD, deje de mover el objetivo cuando la parte superior de la cabeza esté visible y establezca las ubicaciones X, Y y Z en cero. Apague la fuente de luz LED y cierre la cortina oscura alrededor del sistema, luego configure el software de adquisición de imágenes en modo GG multifotón para imágenes de tres fotones y ajuste la potencia debajo de la lente del objetivo a menos de un milivatio. Haga clic en el botón Live en el software de adquisición de imágenes.
Abra los canales de PMT y ajuste la ganancia de PMT y el nivel de fondo según sea necesario. Suba lentamente la lente del objetivo para localizar la superficie de la cabeza monitoreando el canal THG desde los vasos sanguíneos grandes y la superficie de vidrio de la ventana. Después de mover la lente del objetivo cerca de la ventana, aplique agua entre el objetivo y la ventana craneal, luego establezca los valores del eje de todos los motores en cero.
Haga clic en el botón Live en el software de adquisición de imágenes. Abra los canales PMT y ajuste la ganancia de PMT y el nivel de fondo según sea necesario, luego suba lentamente la lente del objetivo para localizar la superficie del deslizamiento de la cubierta monitoreando el canal THG desde los vasos sanguíneos grandes y la superficie de vidrio de la ventana. Ajuste la orientación de la ventana si es necesario, luego ponga a cero los motores para definir la superficie del cerebro.
Realice imágenes y ajuste el nivel de potencia de acuerdo con la profundidad de la imagen. Las imágenes de alta resolución, no invasivas y profundas de las neuronas marcadas genéticamente en el cerebro adulto del pez cebra se logran utilizando microscopía de tres fotones. También se puede observar la distribución de las capas celulares en el tectum óptico y el cerebelo.
La función de cámara del microscopio se utilizó para localizar a los peces. El cráneo se ve en el canal THG, que ayuda a navegar por el cerebro y encontrar la superficie superior. Las neuronas son distinguibles con una alta relación señal-fondo en lo profundo del cerebro adulto.
Aquí se muestran imágenes multicolores de tres fotones de neuronas marcadas con GCaMP6 y vasos sanguíneos marcados con Texas Red junto con señales THG en el cerebro de ratón adulto. Con la optimización de la configuración, se obtuvieron con éxito imágenes de alto contraste de hasta 1,2 milímetros de la superficie del cerebro en la región del hipocampo CA1. Los rastros de actividad de calcio de las neuronas marcadas con GCaMP6s a una profundidad de 750 micrómetros durante una sesión de grabación de 10 minutos mostraron una alta fidelidad de grabación.
Esta configuración puede ayudar a visualizar la actividad neuronal para comprender la función cerebral. También se puede utilizar para rastrear el movimiento celular dentro del tejido biológico para comprender varios sistemas biológicos. Además, la velocidad del flujo sanguíneo también se puede medir para controlar la salud del animal.
