يوفر هذا البروتوكول أساسا لتوسيع الخلايا السرطانية التي بدورها تسمح بإجراء دراسة متعمقة لوظيفة الخلايا السرطانية والحالات الجينومية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر نظام نموذج في المختبر لتقييم تأثير الورم على الاستجابة المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بروتوكولا قائما لإنشاء خطوط الورم الوسيط من أنسجة المريض.
لا يوجد حاليا بروتوكول موحد لهذا النظام النموذجي. الجانب الأكثر صعوبة في هذه التقنية هو وجود تلوث الخلايا الليفية في ثقافات المرور المبكرة. من الأهمية بمكان أن يكون لديك فهم قوي للخلايا الليفية مقابل مورفولوجيا الخلايا السرطانية لتحديد ما إذا كانت محاولات تجويع الخلايا الليفية تعمل.
ابدأ بنقل 10 ملليلتر من كوكتيل هضم الورم الأنزيمي إلى أنبوب التفكك. انقل قطعة أنسجة الورم إلى غطاء معقم من ستة آبار باستخدام مشرط معقم. قم بإزالة جميع الأنسجة الميتة الدهنية والجلطات الدموية باستخدام مشرط وملقط معقمين جديدين.
قطع أنسجة الورم بأكملها إلى شظايا صغيرة ملليمتر مكعب واحد. لضمان عدم جفاف الأنسجة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن المعقم من هانك ، أو HBSS ، إلى أنسجة الورم. انقل شظايا الورم إلى أنبوب التفكك الذي يحتوي على 10 ملليلتر من كوكتيل إنزيمي يهضم الورم.
أغلق الأنبوب بإحكام. ضعه جانبا على مفكك الأنسجة وقم بتزويد المنفصل بالحرارة. حدد الإعداد المبرمج مسبقا على جهاز التفكك إلى إعداد مجموعة تفكيك الورم البشري 37 درجة مئوية 1 وتحقق من الحالة بعد 10 دقائق لضمان عدم الإشارة إلى أي خطأ في الانسداد بواسطة الضوء الأحمر الوامض.
بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة أنبوب التفكك وضعه في غطاء تدفق صفائحي. قم بتصفية الورم المهضوم عن طريق وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وسحب الورم المهضوم باستخدام ماصة 10 ملليلتر على الفلتر. إذا انسد عامل التصفية، فقم بالتبديل إلى فلتر جديد.
شطف أنبوب التفكك مع 10 ملليلتر من وسائط هضم الورم الطازجة وغسل من خلال الفلتر. قم بإزالة الفلتر وتجاهله. ارفع الحجم الإجمالي إلى 40 ملليلتر مع وسط هضم الورم.
جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة شفط ملليلتر متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط السوبرناتانت دون إزعاج الكريات وإعادة تعليق الخلايا باستخدام 10 ملليلتر من وسط الورم المعقم. ثم ، مرة أخرى ، الطرد المركزي للأنابيب وشفط supernatant كما هو موضح.
بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط الورم المعقم وانقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة معقمة من ستة آبار. احتفظ باللوحة في حاضنة عند 37 درجة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، انقل الوسط المستخدم من الورم المهضوم في بئر واحد إلى بئر جديد في نفس الصفيحة المكونة من ستة آبار ، ثم أضف ثلاثة ملليلترات من الورم المعقم المتوسط إلى البئر واحد.
باستخدام مجهر الطور المقلوب، حدد النسبة المئوية لتلوث الخلايا الليفية في مزرعة المرور المبكرة. إذا كان تلوث الخلايا الليفية أكبر من 20٪ من الخلايا في مزرعة المرور المبكر ، فاستمر في الزراعة بعد استبدال وسط الورم بوسط المصل المنخفض. إذا لم يتم تقليل عدد الخلايا الليفية إلى 10٪ أو أقل ، فقم بشطف البئر بلطف باستخدام PBS لإزالة الوسط الذي يحتوي على المصل.
أضف ملليلتر واحد من التربسين لكل بئر في صفيحة من ستة آبار. ضع الصفيحة أو القارورة المكونة من ستة آبار في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة اللوحة أو القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
عندما ترفع الخلايا جزئيا أو تطفو ، قم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين بلطف فقط. ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل. كرر التربسين حتى تتم إزالة ثلاثة إلى أربعة كسور.
جهاز طرد مركزي لجميع الكسور المستقلة عند 500 × g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة شفط سعة مليلترين متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط supernatant دون إزعاج الكرية. أعد تعليق الخلايا باستخدام خمسة ملليلترات من وسط المصل المعقم المخفض.
قم بصفيحة الخلايا في قارورة T-25 لكل جزء ووضع القوارير في حاضنة عند 37 درجة مئوية. للحفظ بالتبريد لخلايا المرور المبكرة ، قم بإذابة أنبوب واحد من وسط التجميد المقتبس. جمع الخلايا عن طريق التربسين عن طريق غسل اللوحة أولا مع PBS وإضافة التربسين كما هو موضح سابقا.
ضع القارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة القارورة من الحاضنة وتحقق من التصاق الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا ترفع أو تطفو ، فقم بإزالة الخلايا المعلقة والتريبسين برفق.
ضع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على حجم مساو أو أكبر من وسط الورم الكامل. امزج محتويات الأنبوب عن طريق السحب بلطف. قم بإزالة 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا للعد.
ثم الطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقية عند 500 × g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تدور الخلايا ، عد باستخدام بروتوكول عد خاص بالمختبر ، مثل التربان الأزرق أو يوديد الأكريدين البرتقالي / البروبيديوم. أعد تعليق الخلايا بعد الطرد المركزي في وسط تجميد بحد أدنى 5 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من وسط التجميد ونقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية هذا إلى 1.5 ملليلتر من التجميد المسمى مسبقا.
ضع الكريوفيالات في غرفة تجميد ذات معدل متحكم فيه وانقلها على الفور إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر. يوضح الشكل زيادة تلوث الألياف بنسبة 80٪ 50٪ و 30٪ مقارنة بثقافة لا تلوث بالخلايا الليفية. يوضح هذا الشكل تلطيخ سطح التدفق الخلوي التمثيلي لأربعة خطوط ورم المتوسطة الأولية ، MESO171 ، MESO176 ، NCIH2452 ، MS TO-211H وخط ورم سرطان الجلد ، MEL526 كعنصر تحكم سلبي.
يمكن أن تعبر خطوط الخلايا هذه عن كل من الميزوثيلين و N-cadherin. كما تظهر أهمية اختبار تأثير الانفصال الإنزيمي على التعبير عن علامة البروتين السطحي حيث أدى كل من التربسين وخليط الكولاجيناز البروتيازي إلى فقدان التعبير السطحي عن N-cadherin ، في حين لم يتأثر CD90. وتشمل الخطوات الهامة المعالجة السليمة للورم بما في ذلك إزالة الدم والدهون قبل الهضم، وتحديد تلوث الخلايا الليفية، وتحديد كيفية الحد من فرط نمو الخلايا الليفية أمر حيوي.
تتضمن إحدى الطرق المهمة التي تتبع هذا الإجراء فحوصات الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا لاختبار قدرة الخلايا التائية الذاتية على التعرف على الخلايا السرطانية المشتقة من المريض. ستحدد هذه التقنية مستقبلات الخلايا التائية الجديدة المضادة للورم والتي يمكن أن تكون ذات أهمية علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، سيسمح لنا بدراسة التفاعل بين الورم والورم المقترن الذي يتسلل إلى الخلايا الليمفاوية وضعف المناعة.
