该协议为肿瘤细胞扩增提供了基础，反过来，允许对肿瘤细胞功能和基因组状态进行深入研究。此外，它还提供了一个体外模型系统来评估肿瘤对免疫反应的影响。该技术的主要优点是它提供了一种基于方案，用于从患者组织建立间皮肿瘤谱系。
目前，此模型系统没有标准化协议。该技术最困难的方面是在早期传代培养中存在成纤维细胞污染。对成纤维细胞与肿瘤细胞形态有深入的了解对于确定成纤维细胞饥饿尝试是否有效至关重要。
首先将10毫升肿瘤消化酶混合物转移到解离管中。使用无菌手术刀将肿瘤组织转移到无菌的六孔板盖上。使用新的无菌手术刀和镊子去除所有脂肪坏死组织和血栓。
将整个肿瘤组织切成一立方毫米的小碎片。为了确保组织不会变干，向肿瘤组织中添加500微升无菌汉克平衡盐溶液或HBSS。将肿瘤片段转移到含有10毫升肿瘤消化酶混合物的解离管中。
紧紧关闭管子。将其盖子朝下放在组织解离器上，并向解离器供热。选择解离器上的预编程设置至37摄氏度的人肿瘤解离试剂盒设置1，并在10分钟后检查状态，以确保闪烁的红灯没有堵塞错误。
一小时后，取出解离管并将其置于层流罩中。通过将70微米的细胞过滤器放在50毫升的锥形管上并使用10毫升移液管将消化的肿瘤移液到过滤器上来过滤消化的肿瘤。如果过滤器堵塞，请切换到新的过滤器。
用10毫升新鲜肿瘤消化培养基冲洗解离管，并通过过滤器洗涤。移除并丢弃过滤器。用肿瘤消化培养基使总体积达到40毫升。
在室温下以500×g离心五分钟。使用连接到真空源的两毫升吸气移液管，在不干扰沉淀的情况下吸出上清液，并使用10毫升无菌肿瘤培养基重悬细胞。然后，再次离心管并吸出上清液，如图所示。
接下来，将细胞重悬于三毫升无菌肿瘤培养基中，并将细胞悬浮液转移到无菌六孔板的一个孔中。将板保持在37度的培养箱中，二氧化碳含量为5%。24小时后，将用过的培养基从一孔中消化的肿瘤转移到同一六孔板中的新孔中，然后向孔中加入三毫升无菌肿瘤培养基。
使用倒置相显微镜，确定早期传代培养物中成纤维细胞污染的百分比。如果成纤维细胞污染大于早期传代培养物中细胞的20%，则在用还原的血清培养基替换肿瘤培养基后继续培养。如果成纤维细胞群体未减少到10%或更低，请用PBS轻轻冲洗孔以除去含有血清的培养基。
在六孔板中每孔加入一毫升胰蛋白酶。将六孔板或烧瓶置于37摄氏度的培养箱中一分钟。从培养箱中取出板或烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。
当细胞部分抬起或漂浮时，轻轻地除去悬浮的细胞和胰蛋白酶。将细胞置于含有等体积或更大体积的完整肿瘤培养基的15毫升锥形管中。重复胰蛋白酶消化，直到去除三到四个馏分。
在室温下以500×g离心所有独立馏分五分钟。使用连接到真空源的两毫升吸气移液器，吸出上清液而不会干扰沉淀。使用5毫升无菌还原血清培养基重悬细胞。
将细胞置于T-25烧瓶中，每个级分并将烧瓶置于37摄氏度的培养箱中。对于早期传代细胞的冷冻保存，解冻一管等分试样的冷冻培养基。通过胰蛋白酶消化收集细胞，首先用PBS洗涤板并添加胰蛋白酶，如前所述。
将烧瓶放入37摄氏度的培养箱中三分钟。从培养箱中取出烧瓶，并使用倒置显微镜检查细胞的粘附性。如果细胞正在抬起或漂浮，轻轻地去除悬浮的细胞和胰蛋白酶。
将细胞置于含有等体积或更大体积的完整肿瘤培养基的15毫升锥形管中。通过轻轻移液混合管的内容物。取出20微升细胞悬浮液进行计数。
然后在室温下以500×g离心剩余的细胞悬浮液五分钟。当细胞旋转时，使用实验室特定的计数方案进行计数，例如台盼蓝或吖啶橙/碘化丙啶。将离心后的细胞重悬于每毫升冷冻培养基中至少5×10的冷冻培养基中的第六个细胞，并将该细胞悬浮液的一毫升转移到预先标记的1.5毫升冷冻管中。
将冷冻管置于受控速率冷冻室中，并立即将其转移到零下80摄氏度。该图显示，与没有成纤维细胞污染的培养物相比，纤维母细胞污染增加了80%50%和30%。该图显示了具有代表性的流式细胞术表面染色的四个原发性间皮瘤肿瘤谱系，MESO171、MESO176、NCIH2452、MS TO-211H和黑色素瘤肿瘤谱系，MEL526为阴性对照。
这些细胞系可以表达间皮素和N-钙粘蛋白。测试酶分离对表面蛋白标志物表达的影响的重要性也显示出来，因为胰蛋白酶和蛋白酶胶原酶混合物都导致N-钙粘蛋白表面表达的损失，而CD90不受影响。重要的步骤包括正确处理肿瘤，包括在消化前去除血液和脂肪，识别成纤维细胞污染，以及确定如何限制成纤维细胞过度生长至关重要。
遵循该程序的一个重要方法包括细胞毒性淋巴细胞测定，以测试自体T细胞识别患者来源的肿瘤细胞的能力。该技术将鉴定可能具有治疗重要性的新的抗肿瘤特异性T细胞受体。此外，它还将使我们能够研究肿瘤与配对肿瘤浸润淋巴细胞和免疫功能障碍之间的相互作用。
