このプロトコルは、腫瘍細胞増殖の基礎を提供し、腫瘍細胞の機能およびゲノム状態の詳細な研究を可能にする。さらに、免疫応答に対する腫瘍の影響を評価するためのin vitroモデルシステムを提供する。この技術の主な利点は、患者組織から中皮腫瘍株を確立するための基礎プロトコルを提供することである。
現在、このモデルシステム用の標準化されたプロトコルはありません。この技術の最も困難な側面は、初期の継代培養における線維芽細胞汚染の存在である。線維芽細胞飢餓の試みが機能しているかどうかを判断するには、線維芽細胞と腫瘍細胞の形態をしっかりと理解することが重要です。
まず、10ミリリットルの腫瘍消化酵素カクテルを解離チューブに移します。腫瘍組織の片を滅菌メスを用いて滅菌6ウェルプレート蓋に移す。新しい滅菌メスと鉗子を使用して、すべての脂肪壊死組織と血栓を除去します。
腫瘍組織全体を1立方ミリメートルの小さな断片に切断する。組織が乾燥しないようにするには、500マイクロリットルの滅菌ハンクスバランスソルト溶液(HBSS)を腫瘍組織に加えます。腫瘍断片を10ミリリットルの腫瘍消化酵素カクテルを含む解離チューブに移す。
チューブをしっかりと閉じます。組織解離器の上にキャップを側面から下ろし、解離器に熱を供給します。解離器の事前にプログラムされた設定を摂氏37度のヒト腫瘍解離キット設定1に選択し、10分後にステータスをチェックして、点滅する赤色のライトで目詰まりエラーが示されていないことを確認します。
1時間後、解離チューブを取り外し、層流フードに入れます。50ミリリットルの円錐管に70マイクロメートルの細胞ストレーナーを置き、フィルター上に10ミリリットルのピペットを使用して消化腫瘍をピペッティングして、消化腫瘍をろ過します。フィルターが詰まった場合は、新しいフィルターに切り替えます。
解離チューブを10ミリリットルの新鮮な腫瘍消化培地ですすぎ、フィルターで洗浄します。フィルターを取り外して廃棄します。腫瘍消化媒体で全量を40ミリリットルにする。
500 x gで室温で5分間遠心分離する。真空源に取り付けられた2ミリリットルの吸引ピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清を吸引し、10ミリリットルの滅菌腫瘍培地を用いて細胞を再懸濁する。次に、再び、チューブを遠心分離し、実証されたように上清を吸引する。
次に、細胞を3ミリリットルの滅菌腫瘍培地に再懸濁し、細胞懸濁液を滅菌6ウェルプレートの1ウェルに移す。プレートを5%二酸化炭素で37度のインキュベーターに保管してください。24時間後、ウェル1で消化された腫瘍から同じ6ウェルプレート内の新しいウェルに使用済み培地を移し、次いで3ミリリットルの滅菌腫瘍培地をウェル1に加える。
倒立相顕微鏡を用いて、継代培養初期における線維芽細胞汚染の割合を求める。継代培養初期において線維芽細胞の汚染が細胞の20%を超える場合は、腫瘍培地を還元血清培地に交換した後も培養を継続する。線維芽細胞集団が10%以下に減少していない場合は、PBSでウェルを穏やかにすすぎ、血清を含む培地を除去する。
6ウェルプレートにウェルあたり1ミリリットルのトリプシンを加える。6ウェルプレートまたはフラスコを摂氏37度のインキュベーターに1分間置きます。プレートまたはフラスコをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡を使用して細胞の接着を確認します。
細胞が部分的に持ち上げたり浮いたりしたら、浮遊した細胞とトリプシンだけを静かに取り除きます。細胞を、同等以上の体積の完全な腫瘍培地を含む15ミリリットルの円錐管に入れる。3〜4つの画分が除去されるまでトリプシン処理を繰り返す。
すべての独立した画分を500 x gで室温で5分間遠心分離します。真空源に取り付けられた2ミリリットルの吸引ピペットを用いて、ペレットを乱すことなく上清を吸引する。5ミリリットルの滅菌還元血清培地を用いて細胞を再懸濁する。
細胞をT-25フラスコに各画分ごとにプレートし、フラスコを摂氏37度のインキュベーターに入れます。継代初期細胞の凍結保存のために、小分けされた凍結培地の1本のチューブを解凍する。最初にプレートをPBSで洗浄し、前述のようにトリプシンを添加することによって、トリプシン化によって細胞を集める。
フラスコを摂氏37度のインキュベーターに3分間置きます。フラスコをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡を用いて細胞の接着を確認した。細胞が浮き上がったり浮いたりしている場合は、浮遊した細胞とトリプシンを静かに取り除きます。
細胞を、同等以上の体積の完全な腫瘍培地を含む15ミリリットルの円錐管に入れる。チューブの内容物をピペッティングで穏やかに混ぜる。計数のために20マイクロリットルの細胞懸濁液を除去する。
次いで、残りの細胞懸濁液を500 x gで室温で5分間遠心分離する。細胞が回転しているときは、トリパンブルーやアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムなどのラボ固有の計数プロトコルを使用してカウントします。遠心分離後の細胞を凍結培地に最小5 x 10~6個目の凍結培地で再懸濁し、この細胞懸濁液の1ミリリットルを予め標識された1.5ミリリットルのクライオバイアルに移す。
クライオバイアルを制御された速度凍結チャンバーに入れ、すぐにマイナス80°Cに移します。この図は、線維芽細胞汚染のない培養物と比較して、繊維芽細胞汚染が80%50%および30%増加していることを示しています。この図は、4つの原発性中皮腫腫瘍株、MESO171、MESO176、NCIH2452、MS TO−211Hおよび黒色腫腫瘍株、MEL526をネガティブコントロールとして代表的なフローサイトメトリー表面染色を示す。
これらの細胞株は、メソセリンおよびN-カドヘリンの両方を発現することができる。表面タンパク質マーカー発現に対する酵素的剥離の影響を試験することの重要性は、トリプシンおよびプロテアーゼコラゲナーゼ混合物の両方がN-カドヘリンの表面発現の喪失をもたらしたが、CD90は影響を受けなかったとしても示されている。重要なステップには、消化前の血液および脂肪の除去、線維芽細胞汚染の特定、および線維芽細胞の過剰増殖を制限する方法の決定を含む腫瘍の適切な処理が含まれる。
この手順に続く重要な方法には、患者由来の腫瘍細胞を認識する自家T細胞の能力を試験するための細胞傷害性リンパ球アッセイが含まれる。この技術は、治療上重要な新しい抗腫瘍特異的T細胞受容体を同定する。さらに、腫瘍と対をなす腫瘍浸潤リンパ球との相互作用や免疫機能障害を研究することができます。
