Этот протокол обеспечивает основу для расширения опухолевых клеток, что, в свою очередь, позволяет углубленно изучать функцию опухолевых клеток и геномные состояния. Кроме того, он предоставляет модельную систему in vitro для оценки влияния опухоли на иммунный ответ. Основным преимуществом этой методики является то, что она обеспечивает основанный протокол для установления линий мезотелиальной опухоли из ткани пациента.
В настоящее время нет стандартизированного протокола для этой модельной системы. Наиболее сложным аспектом этого метода является наличие загрязнения фибробластами в культурах раннего прохождения. Крайне важно иметь четкое представление о фибробластах и морфологии опухолевых клеток, чтобы определить, работают ли попытки голодания фибробластов.
Начните с переноса 10 миллилитров переваривающего опухоль ферментативного коктейля в диссоциационную трубку. Переложите кусочек опухолевой ткани на стерильную шестилуночную пластинчатую крышку с помощью стерильного скальпеля. Удалите все жировые некротические ткани и сгустки крови с помощью нового стерильного скальпеля и щипцов.
Разрезать всю опухолевую ткань на один кубический миллиметр мелкими фрагментами. Чтобы ткань не пересыхала, добавьте 500 микролитров стерильного раствора сбалансированной соли Хэнка, или HBSS, в опухолевую ткань. Перенос опухолевых фрагментов в диссоциационную трубку, содержащую 10 миллилитров переваривающего опухоль ферментативного коктейля.
Плотно закройте трубку. Поместите его колпачком вниз на тканевый диссоциатор и подайте тепло диссоциатору. Выберите предварительно запрограммированную настройку на диссоциаторе для установки 1 набора для диссоциации опухоли человека 37 градусов цельсия и проверьте состояние через 10 минут, чтобы убедиться, что мигающий красный свет не указывает на ошибку засорения.
Через час снимите диссоциационную трубку и поместите ее в ламинарную вытяжку. Отфильтруйте переваренную опухоль, поместив 70-микрометровый клеточный ситечко на 50-миллилитровую коническую трубку и пипетировав переваренную опухоль с помощью 10-миллилитровой пипетки на фильтр. Если фильтр засоряется, переключитесь на новый фильтр.
Промыть диссоциационную трубку 10 миллилитрами свежих опухолевых сред пищеварения и промыть через фильтр. Удалите и удалите фильтр. Доведите общий объем до 40 миллилитров с помощью опухолевой среды пищеварения.
Центрифуга при 500 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Используя двухмиллилитровую аспирационную пипетку, прикрепленную к вакуумному источнику, аспирируют супернатант, не нарушая гранулу, и повторно саспендируют клетки, используя 10 миллилитров стерильной опухолевой среды. Затем, опять же, центрифугируйте трубки и аспирируйте супернатант, как показано.
Далее повторно суспендируют клетки в трех миллилитрах стерильной опухолевой среды и переносят клеточную суспензию в одну лунку стерильной шестилуночной пластины. Держите пластину в инкубаторе при 37 градусах с 5% углекислым газом. Через 24 часа перенесите использованную среду из переваренной опухоли в одной лунке в новую лунку в той же шестилуночной пластине, затем добавьте три миллилитра стерильной опухолевой среды в хорошо одну.
С помощью инвертированного фазового микроскопа определяют процент загрязнения фибробластами в культуре раннего прохождения. Если загрязнение фибробластов превышает 20% клеток в культуре раннего прохождения, продолжают культивирование после замены опухолевой среды восстановленной сывороточной средой. Если популяция фибробластов не уменьшается до 10% или менее, осторожно промойте лунку PBS, чтобы удалить среду, содержащую сыворотку.
Добавьте один миллилитр трипсина на лунку в шестилуночную пластину. Поместите шестилуночную пластину или колбу в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на одну минуту. Извлеките пластину или колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа.
Когда клетки частично поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и только трипсин. Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды. Повторяйте трипсинизацию до тех пор, пока не будет удалено три-четыре фракции.
Центрифугируйте все независимые фракции при 500 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Используя двухмиллилитровую аспирационную пипетку, прикрепленную к источнику вакуума, аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Повторное суспендирование клеток с использованием пяти миллилитров стерильной восстановленной сывороточной среды.
Обложите ячейки колбой Т-25 для каждой фракции и поместите колбы в инкубатор при температуре 37 градусов цельсия. Для криоконсервации клеток раннего прохода разморозить одну трубку аликвотированной морозильной среды. Соберите клетки путем трипсинизации, сначала промыв пластину PBS и добавив трипсин, как было продемонстрировано ранее.
Поместите колбу в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на три минуты. Извлеките колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если клетки поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и трипсин.
Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды. Смешайте содержимое трубки, аккуратно дозируя. Удалите 20 микролитров клеточной суспензии для подсчета.
Затем центрифугируют оставшуюся клеточную суспензию при 500 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Когда клетки вращаются, подсчитывайте, используя лабораторный протокол подсчета, такой как трипан синий или акридин оранжевый / йодид пропидия. Повторно суспендируют клетки после центрифугирования во фриз-среде с минимумом от 5 х 10 до шестых клеток на миллилитр замороженной среды и переносят один миллилитр этой клеточной суспензии в предварительно меченые 1,5 миллилитра криовиалов.
Поместите криовиалы в камеру замораживания с контролируемой скоростью и немедленно перенесите их до минус 80 градусов по Цельсию. На рисунке показано увеличение загрязнения волокнистыми пластами на 80% 50% и 30% по сравнению с культурой без загрязнения фибробластами. На этом рисунке показано репрезентативное окрашивание поверхности проточной цитометрии четырех первичных линий опухоли мезотелиомы, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H и линии опухоли меланомы, MEL526 в качестве отрицательного контроля.
Эти клеточные линии могут экспрессировать как мезотелин, так и N-кадгерин. Важность тестирования влияния ферментативной отслойки на экспрессию поверхностных белковых маркеров также показана, поскольку как трипсин, так и смесь коллагеназы протеазы приводили к потере поверхностной экспрессии N-кадгерина, в то время как CD90 не подвергался воздействию. Важные шаги включают надлежащую обработку опухоли, включая удаление крови и жира перед пищеварением, выявление загрязнения фибробластами и определение того, как ограничить чрезмерный рост фибробластов, что жизненно важно.
Важный метод, следующий за этой процедурой, включает цитотоксические анализы лимфоцитов для проверки способности аутологичных Т-клеток распознавать опухолевые клетки, полученные от пациента. Этот метод позволит идентифицировать новые противоопухолевые Т-клеточные рецепторы, которые могут иметь терапевтическое значение. Кроме того, это позволит изучить взаимодействие между опухолью и парными опухолевыми инфильтрирующими лимфоцитами и иммунной дисфункцией.
