Dieses Protokoll bietet eine Grundlage für die Tumorzellexpansion, die wiederum eine eingehende Untersuchung der Tumorzellfunktion und der genomischen Zustände ermöglicht. Darüber hinaus bietet es ein In-vitro-Modellsystem, um den Einfluss des Tumors auf die Immunantwort zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein basiertes Protokoll zur Etablierung mesothelartiger Tumorlinien aus Patientengewebe bietet.
Es gibt derzeit kein standardisiertes Protokoll für dieses Modellsystem. Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist das Vorhandensein einer Fibroblastenkontamination in frühen Passagekulturen. Es ist wichtig, ein solides Verständnis von Fibroblasten im Vergleich zur Tumorzellmorphologie zu haben, um festzustellen, ob Fibroblasten-Hungerversuche funktionieren.
Beginnen Sie damit, 10 Milliliter tumorverdauenden enzymatischen Cocktail in einen Dissoziationsschlauch zu übertragen. Übertragen Sie das Stück Tumorgewebe mit einem sterilen Skalpell auf einen sterilen Deckel mit sechs Bohrlöchern. Entfernen Sie alle fetten nekrotischen Gewebe und Blutgerinnsel mit einem neuen sterilen Skalpell und einer neuen Pinzette.
Schneiden Sie das gesamte Tumorgewebe in einen Kubikmillimeter kleine Fragmente. Um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet, fügen Sie dem Tumorgewebe 500 Mikroliter sterile Hank's Balanced Salt-Lösung (HBSS) hinzu. Übertragen Sie Tumorfragmente in den Dissoziationsschlauch, der 10 Milliliter tumorverdauenden enzymatischen Cocktail enthält.
Schließen Sie das Rohr fest. Legen Sie die Kappe mit der Kappe nach unten auf den Gewebedissoziator und versorgen Sie den Dissoziator mit Wärme. Wählen Sie die vorprogrammierte Einstellung am Dissoziator auf die 37 Grad Celsius menschliche Tumordissoziationskit-Einstellung 1 und überprüfen Sie den Status nach 10 Minuten, um sicherzustellen, dass kein Verstopfungsfehler durch das blinkende rote Licht angezeigt wird.
Entfernen Sie nach einer Stunde das Dissoziationsrohr und legen Sie es in eine Laminar-Flow-Haube. Filtern Sie den verdauten Tumor, indem Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Konusröhrchen legen und den verdauten Tumor mit einer 10-Milliliter-Pipette auf den Filter pipettieren. Wenn der Filter verstopft, wechseln Sie zu einem neuen Filter.
Spülen Sie den Dissoziationsschlauch mit 10 Millilitern frischen Tumoraufschlussmedien aus und waschen Sie ihn durch den Filter. Entfernen und verwerfen Sie den Filter. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem Tumorverdauungsmedium auf 40 Milliliter.
Bei 500 x g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Mit einer zwei Milliliter Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern sterilem Tumormedium. Dann zentrigieren Sie die Röhrchen und aspirieren Sie den Überstand wie gezeigt.
Als nächstes suspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern sterilem Tumormedium und übertragen die Zellsuspension in eine Vertiefung einer sterilen Sechs-Well-Platte. Halten Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad mit 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden das verwendete Medium aus dem verdauten Tumor in Brunnen eins in einen neuen Brunnen in derselben Sechs-Well-Platte überführen und dann drei Milliliter steriles Tumormedium zu Well One hinzufügen.
Bestimmen Sie mit einem Inverted-Phase-Mikroskop den Prozentsatz der Fibroblastenkontamination in der frühen Passagekultur. Wenn die Fibroblastenkontamination mehr als 20% der Zellen in der frühen Passagekultur beträgt, kultivieren Sie weiter, nachdem Sie das Tumormedium durch das reduzierte Serummedium ersetzt haben. Wenn die Fibroblastenpopulation nicht auf 10% oder weniger reduziert ist, spülen Sie den Brunnen vorsichtig mit PBS ab, um das serumhaltige Medium zu entfernen.
Fügen Sie einen Milliliter Trypsin pro Vertiefung in eine Platte mit sechs Vertiefungen hinzu. Legen Sie die Platte oder den Kolben mit sechs Vertiefungen für eine Minute in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Platte oder den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop.
Wenn sich die Zellen teilweise heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und nur Trypsin. Legen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. Wiederholen Sie das Trypsinisieren, bis drei bis vier Brüche entfernt sind.
Alle unabhängigen Fraktionen bei 500 x g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Mit einer zwei Milliliter Ansaugpipette, die an einer Vakuumquelle befestigt ist, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern sterilem reduziertem Serummedium.
Beschichten Sie die Zellen in einem T-25-Kolben für jede Fraktion und legen Sie die Kolben in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Zur Kryokonservierung von Zellen der frühen Passage tauen Sie ein Röhrchen alizitiertes Gefriermedium auf. Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinisierung, indem Sie zuerst die Platte mit PBS waschen und Trypsin hinzufügen, wie zuvor gezeigt.
Stellen Sie den Kolben für drei Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Adhäsion der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Wenn sich die Zellen heben oder schweben, entfernen Sie vorsichtig die suspendierten Zellen und das Trypsin.
Legen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre, die ein gleiches oder größeres Volumen an vollständigem Tumormedium enthält. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch vorsichtiges Pipettieren. Entfernen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension zum Zählen.
Anschließend zentrifugieren Sie die restliche Zellsuspension bei 500 x g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn sich die Zellen drehen, zählen Sie mit einem laborspezifischen Zählprotokoll, z. B. Trypanblau oder Acridin Orange / Propidiumiodid. Resuspendieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation in Gefriermedium mit einem Minimum von 5 x 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter Gefriermedium und übertragen Sie einen Milliliter dieser Zellsuspension auf vormarkierte 1,5 Milliliter Kryofrüchte.
Legen Sie die Kryofrüchte in eine kontrollierte Gefrierkammer und übertragen Sie sie sofort auf minus 80 Grad Celsius. Die Abbildung zeigt eine zunehmende Faserblastenkontamination von 80% 50% und 30% im Vergleich zu einer Kultur ohne Fibroblastenkontamination. Diese Abbildung zeigt die repräsentative Durchflusszytometrie-Oberflächenfärbung von vier primären Mesotheliom-Tumorlinien, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H und einer Melanom-Tumorlinie, MEL526 als Negativkontrolle.
Diese Zelllinien können sowohl Mesothelin als auch N-Cadherin exprimieren. Die Bedeutung der Prüfung des Einflusses der enzymatischen Ablösung auf die Expression von Oberflächenproteinmarkern wird ebenfalls gezeigt, da sowohl Trypsin als auch die Proteasekollagenasemischung zum Verlust der Oberflächenexpression von N-Cadherin führten, während CD90 nicht beeinflusst wurde. Wichtige Schritte umfassen die ordnungsgemäße Verarbeitung des Tumors, einschließlich der Entfernung von Blut und Fett vor der Verdauung, die Identifizierung der Fibroblastenkontamination und die Bestimmung, wie die Überwucherung der Fibroblasten begrenzt werden kann.
Eine wichtige Methode nach diesem Verfahren sind zytotoxische Lymphozyten-Assays, um die Fähigkeit autologer T-Zellen zu testen, von Patienten abgeleitete Tumorzellen zu erkennen. Diese Technik wird neue antitumorspezifische T-Zell-Rezeptoren identifizieren, die von therapeutischer Bedeutung sein könnten. Darüber hinaus wird es uns ermöglichen, die Wechselwirkung zwischen Tumor und gepaarten tumorinfiltrierenden Lymphozyten und Immundysfunktion zu untersuchen.
