Este protocolo proporciona una base para la expansión de las células tumorales que, a su vez, permite un estudio en profundidad de la función de las células tumorales y los estados genómicos. Además, proporciona un sistema modelo in vitro para evaluar el impacto del tumor en la respuesta inmune. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un protocolo basado para establecer líneas tumorales mesoteliales a partir del tejido del paciente.
Actualmente no existe un protocolo estandarizado para este sistema modelo. El aspecto más difícil de esta técnica es la presencia de contaminación por fibroblastos en cultivos de paso temprano. Es fundamental tener una comprensión sólida de los fibroblastos frente a la morfología de las células tumorales para determinar si los intentos de inanición de fibroblastos están funcionando.
Comience transfiriendo 10 mililitros de cóctel enzimático de digestión tumoral a un tubo de disociación. Transfiera el trozo de tejido tumoral a una tapa estéril de la placa de seis pocillos con un bisturí estéril. Elimine todos los tejidos necróticos grasos y los coágulos de sangre con un nuevo bisturí estéril y fórceps.
Cortar todo el tejido tumoral en un milímetro cúbico pequeño fragmentos. Para asegurarse de que el tejido no se seque, agregue 500 microlitros de solución estéril de sal equilibrada de Hank, o HBSS, al tejido tumoral. Transfiera fragmentos tumorales al tubo de disociación que contiene 10 mililitros de cóctel enzimático de digestión tumoral.
Cierre el tubo herméticamente. Coloque la tapa hacia abajo en el disociador de tejido y suministre calor al disociador. Seleccione la configuración preprogramada en el disociador al kit de disociación de tumores humanos de 37 grados Celsius configuración 1 y verifique el estado después de 10 minutos para asegurarse de que la luz roja parpadeante no indique ningún error de obstrucción.
Después de una hora, retire el tubo de disociación y colóquelo en una campana de flujo laminar. Filtre el tumor digerido colocando un colador de células de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros y pipeteando el tumor digerido usando una pipeta de 10 mililitros en el filtro. Si el filtro se obstruye, cambie a un filtro nuevo.
Enjuague el tubo de disociación con 10 mililitros de medios de digestión tumoral frescos y lave a través del filtro. Retire y deseche el filtro. Lleve el volumen total a 40 mililitros con el medio de digestión del tumor.
Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Usando una pipeta aspiradora de dos mililitros unida a una fuente de vacío, aspire el sobrenadante sin alterar el gránulo y resuspenda las células usando 10 mililitros de medio tumoral estéril. Luego, de nuevo, centrifuga los tubos y aspira el sobrenadante como se ha demostrado.
A continuación, resuspend las células en tres mililitros de medio tumoral estéril y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa estéril de seis pocillos. Mantenga la placa en una incubadora a 37 grados con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, transfiera el medio utilizado del tumor digerido en el pozo uno a un nuevo pozo en la misma placa de seis pocillos, luego agregue tres mililitros de medio tumoral estéril al pozo uno.
Utilizando un microscopio de fase invertida, determine el porcentaje de contaminación por fibroblastos en el cultivo de paso temprano. Si la contaminación de fibroblastos es superior al 20% de las células en el cultivo de paso temprano, continúe el cultivo después de reemplazar el medio tumoral con el medio sérico reducido. Si la población de fibroblastos no se reduce al 10% o menos, enjuague suavemente el pozo con PBS para eliminar el medio que contiene suero.
Agregue un mililitro de tripsina por pozo en una placa de seis pocillos. Coloque la placa o matraz de seis pocillos en una incubadora a 37 grados centígrados durante un minuto. Retire la placa o el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido.
Cuando las células estén parcialmente levantadas o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina solamente. Coloque las células en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo. Repita la tripsinización hasta que se eliminen de tres a cuatro fracciones.
Centrifugar todas las fracciones independientes a 500 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Usando una pipeta aspiradora de dos mililitros unida a una fuente de vacío, aspire el sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspend las células utilizando cinco mililitros de medio sérico reducido estéril.
Coloque las células en un matraz T-25 para cada fracción y coloque los matraces en una incubadora a 37 grados centígrados. Para la criopreservación de las células de paso temprano, descongele un tubo de medio de congelación alicitado. Recolecte las células por tripsinización lavando primero la placa con PBS y agregando tripsina como se demostró anteriormente.
Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados durante tres minutos. Retire el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están levantando o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina.
Coloque las células en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo. Mezcle el contenido del tubo pipeteando suavemente. Retire 20 microlitros de suspensión celular para contar.
Luego centrifugue la suspensión de la celda restante a 500 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Cuando las células estén girando, cuente utilizando un protocolo de conteo específico del laboratorio, como el azul de tripano o el yoduro de naranja acridina / propidio. Resuspender las células después de la centrifugación en medio de congelación con un mínimo de 5 x 10 a la sexta célula por mililitro de medio de congelación y transferir un mililitro de esta suspensión celular a 1,5 mililitros preetiquetados de crioviales.
Coloque los crioviales en una cámara de congelación de velocidad controlada y transfiéralos inmediatamente a menos 80 grados centígrados. La figura muestra un aumento de la contaminación por fibroblastos del 80%50% y 30% en comparación con un cultivo sin contaminación por fibroblastos. Esta figura muestra la tinción superficial de citometría de flujo representativa de cuatro líneas tumorales de mesotelioma primario, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H y una línea tumoral de melanoma, MEL526 como control negativo.
Estas líneas celulares pueden expresar tanto mesotelina como N-cadherina. La importancia de probar el impacto del desprendimiento enzimático en la expresión de marcadores de proteínas de superficie también se muestra, ya que tanto la tripsina como la mezcla de proteasa colagenasa resultaron en la pérdida de la expresión superficial de N-cadherina, mientras que CD90 no se vio afectada. Los pasos importantes incluyen el procesamiento adecuado del tumor, incluida la extracción de sangre y grasa antes de la digestión, la identificación de la contaminación por fibroblastos y la determinación de cómo limitar el crecimiento excesivo de fibroblastos es vital.
Un método importante después de este procedimiento incluye ensayos de linfocitos citotóxicos para probar la capacidad de las células T autólogas para reconocer las células tumorales derivadas del paciente. Esta técnica identificará nuevos receptores de células T específicos antitumorales que podrían ser de importancia terapéutica. Además, nos permitirá estudiar la interacción entre el tumor y los linfocitos infiltrantes tumorales pareados y la disfunción inmune.
