يسلط هذا البروتوكول الضوء على الخطوات الرئيسية لتضخيم الخلايا الظهارية الأنفية الأولية وتمييزها والحفاظ عليها بالتبريد. في ظروف ثقافتنا، تحاكي الخلايا الظهارية الأنفية الأولية ظهارة الرئة. وهذا يسمح للثقافات المشتقة من المريض ودراسات الطب الشخصي من الخلايا الطازجة أو المخازن الحيوية.
يمكن استخدام الثقافات الظهارية الأنفية المشتقة من المريض لتقييم نشاط CFTR والمساعدة في علاج التليف الكيسي من خلال تقييم استجابة المريض الفردية للعلاجات الجديدة. ستوضح الإجراء أوريلي هاتون ، وهي مهندسة من مختبري. للبدء ، تنمو الخلايا الظهارية الأنفية أو HNE ، في 10 ملليلتر من وسط التضخيم.
احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون في قارورة مغلفة بالكولاجين 75 سم مربع حتى تصل إلى 80 إلى 90 ٪ التقاء. تغيير الوسط كل 48 إلى 72 ساعة. في وقت لاحق ، اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من المغنيسيوم و DPBS الخالي من الكالسيوم.
استنشق وتجاهل المياه المالحة. قبل إضافة ملليلتر من 0.25٪ من التربسين وإعادة القارورة إلى الحاضنة لمدة ثماني إلى 12 دقيقة. في وقت لاحق ، اضغط على القارورة بإحكام براحة اليد للمساعدة في انفصال الخلايا.
أضف 10 ملليلتر من وسط التضخيم لوقف التفاعل الإنزيمي. شطف القارورة بقوة باستخدام ماصة 10 ملليلتر لرسم وطرد وسط التضخيم على سطح القارورة لشطف وفصل الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة.
أعد تعليق الكريات في خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط التضخيم. ثم عد الخلايا على مقياس الدم. بعد عد الخلايا ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من supernatant.
ثم أعد تعليق الكريات في وسط التجميد المخصب للحصول على ثلاث إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر ووضعها في قارورة التبريد. قم بتجميد الخلايا ببطء عن طريق خفض درجة الحرارة بمقدار درجة مئوية واحدة تقريبا في الدقيقة في حاوية تجميد مناسبة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في اليوم التالي ، انقل العينة المحفوظة إلى حاوية تخزين النيتروجين للتخزين على المدى الطويل.
قم بتدفئة وسط التضخيم المحضر حديثا في حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية. قم بإزالة قوارير التبريد من خزان تخزين النيتروجين ووضعها بسرعة في الحمام المائي ، مع الحرص على عدم غمر القارورة بأكملها في الماء. قم بإزالة قوارير التبريد من الحمام المائي عندما تبقى قطرة صغيرة مجمدة فقط.
امسح القوارير بالكحول بنسبة 70٪ وضعها تحت غطاء المحرك. باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ، انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط التضخيم الدافئ بطريقة قطرة.
بعد دقيقة واحدة ، أضف ملليلتر آخر من وسط التضخيم وانتظر لمدة دقيقة. أضف 10 ملليلتر من وسط التضخيم وأجهزة الطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. شفط والتخلص من supernatant.
أعد تعليق الكريات في حجم وسط التضخيم المطلوب لتحقيق كثافة خلية تبلغ 10 مرات إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. بعد بذر الخلايا على قارورة مغلفة بالكولاجين بمساحة 25 سنتيمترا مربعا ، تحتوي على وسط تضخيم ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. راقب بصريا تمدد الخلية على مدى يومين إلى ثلاثة أيام قبل إجراء تضخيم الخلية كما هو موضح سابقا.
زرع الخلايا بكثافة 3.3 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مرشح على مرشحات مسامية مغلفة بالكولاجين بسعة 0.33 سنتيمتر مربع ، تستكمل ب 300 ميكرولتر من وسط التضخيم في الجانب القمي و 900 ميكرولتر من وسط سائل الهواء في الجانب القاعدي. بعد ثلاثة أيام ، قم بشفط الوسط القمي واستزراع الخلايا في واجهة الهواء السائل لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع في الوسط السائل الهوائي لإنشاء ظهارة متباينة. تغيير الوسط القاعدي كل 48 إلى 72 ساعة.
أظهرت خلايا HNE الطازجة المستزرعة في واجهة الهواء السائل سمات نموذجية للظهارة التنفسية المستقطبة والمتباينة. في عينات خلايا HNE البالغ عددها 78 عينة ، تمت مقارنة معدلات النجاح في تنظيف الأنف بالفرشاة على الفور وبعد يوم إلى سبعة أيام من النقل في وسط التنظيف. كان المتوسط الأولي للنسبة المئوية للثقافات الناجحة 82٪ ووصل إلى 87٪ في العينات المبذرة بين صفر إلى خمسة أيام.
83٪ من العينات التي تميزت بنجاح في ظروف جديدة كانت ناجحة أيضا في العينات المحفوظة بالتبريد. وبالمثل ، في العينات التي فشلت في التمييز في الظروف الجديدة ، لم ينجح 71٪ أيضا في ظروف ذوبان الجليد. علاوة على ذلك ، فشلت 50٪ من العينات المجمدة بين اثنين إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل قارورة تبريد في النمو عند إذابتها ، حيث وصلت إلى 80٪ لأقل من اثنين في 10 إلى الخلايا الست.
بالنسبة للتغير في تيار الدائرة القصيرة استجابة للفورسكولين وتغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172 في خلايا HNE المعالجة ب DMSO ، لم يلاحظ أي فرق كبير بين HNE المذاب الطازج أو المجمد. عند العلاج ، أظهر كلا النوعين من الخلايا تصحيحا كبيرا مع زيادة في تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة للفورسكولين وانخفاض في تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172. تم تقييم الاستجابة التصحيحية للعلاجات المزدوجة لوظيفة CFTR مقارنة بتغير تيار الدائرة القصيرة لخلايا HNE المعالجة ب DMSO استجابة للفورسكولين واستجابة لمثبط CFTR 172 تم تحسينها بشكل كبير بواسطة كل من VX-809 بالإضافة إلى VX-770 و VX-661 بالإضافة إلى VX-770.
تمت مقارنة ثلاثة علاجات مختلفة لمغير CFTR في HNE من ستة مرضى متماثلي الزيجوت F508del. عند استخدامه مع مصحح CFTR ومحفز ، كل من محولات الرأس و CFTR ، قام بتصحيح تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لتغير تيار الفورسكولين والدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172 إلى حد مماثل. عند تجميد خلايا HNE ، من المهم أن يكون لديك ما لا يقل عن 3 ملايين خلية لكل قارورة تبريد لزيادة فرص الحصول على نتيجة جيدة عند الذوبان.
وقد ثبت أن نشاط CFTR في خلايا HNE هو نموذج تنبؤي جيد لتقييم وضبط العلاجات الشخصية في التليف الكيسي.
