تسمح طريقة MycoPatt باستكشاف متعمق للاستعمار الفطري المفصلي في الجذور. تشير الخرائط الفطرية إلى التوسع الفطري وتقدم الموقع الحقيقي لكل هيكل كنمط محدد. يتم تحليل الاستعمار الفطري بشكل موضوعي بدقة 1٪.
يتم تحويل كل جزء جذر تلقائيا إلى مصفوفة رقمية ويولد قاعدة بيانات واسعة من معلمات الاستعمار. للبدء ، قم بإزالة الجذور من الثلاجة ووضعها على منصة عمل لإذابتها في درجة حرارة الغرفة. لإجراء تطهير الجذر ، ضع جميع الجذور من نبات واحد في جرة من 30 إلى 50 ملليلتر ، ثم قم بإعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 10٪ بماء الصنبور وصبه في الجرة حتى يغطي الجذور بالكامل.
هز الجرة بقوة لمدة دقيقة إلى دقيقتين للتشتت المتجانس لمحلول التطهير في الجذور. اسمح للجذور بالبقاء في محلول المقاصة لمدة 48 ساعة. لشطف الجذر ، مرر محتوى الجرة من خلال غربال.
شطف الجذور عدة مرات في ماء الصنبور حتى تتم إزالة محلول المقاصة تماما. بعد ذلك ضع الجذور المغسولة في جرة نظيفة للتلطيخ. ثم قم بإعداد محلول خل الحبر بنسبة خمسة إلى خمسة بالمائة بماء الصنبور.
اسكبه في الجرة حتى يغطي الجذور وهزه لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد 48 ساعة لإزالة البقع جزئيا ، اشطف الجذور الملطخة في ماء الصنبور لمدة دقيقة إلى دقيقتين. هز الجرة بقوة لإزالة محلول التلطيخ الإضافي.
كرر الإجراء حتى تصبح الجذور واضحة للتقييم المجهري. لتجزئة الجذر ، ضع الجذور الملطخة على لوح تقطيع مقشر. قطع الجذور إلى شرائح سنتيمتر واحد.
اختر 15 شريحة لكل متغير. بعد ذلك ، انشر الجذور على شريحة لإعداد المقطع ، واستخدم حقيبة تصفيح لتغطية الجذور وسحقها بلطف ، بدءا من الحافة. استخدم أداة بلاستيكية ناعمة لعرض الجذور على الشريحة.
قم بإزالة الحقيبة الترققية بعناية وقم بتغطية العينة بقسيمة غطاء. أضف الماء إلى زاوية من الشريحة باستخدام ماصة ، واترك الماء ينتشر ببطء على الشريحة. قم بإزالة الماء الزائد بمنشفة ورقية.
للتحليل المجهري ، استخدم مجهرا مجهرا مزودا بكاميرا جيدة الدقة. تحليل الشرائح بدءا من طرف. التقط كل حقل مجهري.
استخدم تكبير 10 أو 40x للجذور السميكة و 40x للجذور الرقيقة. بعد الالتقاط ، أعد تسمية كل صورة برمز يسمح بتجميع ما بعد التجميع الحقيقي لأجزاء الجذر. استخدم برنامج العرض التقديمي لتصميم لوحة رسم لتجميع الصور، واضبط العرض بعرض عرضين إلى ثلاثة سنتيمترات من عرض الصورة.
بعد التقاط 15 صورة، أضف جميع الصور الملتقطة من مقطع واحد بترتيب التقاطها، بدءا من صورة واحدة إلى 15 صورة، وأعد بناء كامل طول المقطع الجذر. بعد ذلك ، استخدم المحاذاة الرأسية لمحاذاة الصور في الوسط والتأكد من أن كل صورة تتبع الصورة السابقة. ضع شبكة من 10 × 150 خلية على جميع الصور لتغطية جزء الجذر بأكمله.
بالإضافة إلى ذلك، ضع شبكة 10 × 10 على كل صورة وفي كل خلية من هذه الشبكة، أدخل رقما من واحد إلى ستة إذا كانت بنية mycorrhizal أو AM المفصلية مرئية، أو اتركها فارغة إذا لم تكن هناك بنية AM. أضف جدولا لشبكة من 10 خلايا بعرض وطول 150 خلية. قم بتغيير الجدول ذي الأبعاد إلى عرض الصور، ثم قم بتغيير طول الجدول ليشمل جميع الصور.
لتسجيل الاستعمار الفطري ، استخدم الرقم الفريد لتسجيل كل نوع من أنواع البنية كما هو موضح في طريقة نمط mycorrhizal. استخدم واحدا للهيفاي ، واثنان للمفصليات ، وثلاثة للحويصلات ، وأربعة للجراثيم ، وخمسة للخلايا المساعدة ، وستة لنقاط الدخول. سجل كل بنية فطرية ملحوظة من كل خلية من الشبكات المطبقة سابقا.
بعد التسجيل ، أدخل جميع الدرجات التي تم الحصول عليها في جدول بيانات MycoPatt. استخدم وظيفة نسخ اللصق لنقل كافة الدرجات من العرض التقديمي إلى الورقة الأولى المسماة البيانات الأولية. بالنسبة للتحليل الأساسي، استخدم الورقة الثالثة المسماة المعلمات لتصور النتائج كنسب مئوية بشكل منفصل في ثلاثة أشكال.
استخدم الأعمدة من A إلى K لتحليل الصورة الأفقية للاستعمار، والأعمدة من M إلى W للصورة الرأسية للاستعمار، والأعمدة من Y إلى الذكاء الاصطناعي لتحليل الاستعمار المستعرض لكل مربع من المربعات 15 10 × 10 ومتوسط الاستعمار النهائي. بعد ذلك ، قم بتطبيق التعريفات والصيغ الخاصة بكل معلمة. لإنتاج واستخراج الخرائط الفطرية ، تصور الصورة التي تم الحصول عليها من تحويل رمز الهياكل الفطرية إلى ألوان في الورقة الثانية المسماة الرسوم البيانية.
ثم قم بتصدير الصورة الناتجة في ورقة الرسم البياني كصورة واستخدم رمز اللون في وسيلة الإيضاح لتحليل أنماط mycorrhizal. لتحليل الخريطة الفطرية ، حدد أهم الهياكل وتجميعها. ثم صف نمط الاستعمار الفطري الذي لوحظ في الجذور التي تم تحليلها ، تليها استراتيجية استعمار تستند إلى التطور الهيكلي الملحوظ في الجذر ، ونمط التفرع ، وتطور الحويصلة المفصلية.
يوفر هذا البروتوكول تفاصيل الهياكل الفطرية مع تباين جيد بين الهياكل الفطرية والخلايا الجذرية ل Zea mays و Festal rubra. أدت إجراءات الإزالة والتلطيخ غير الناجحة إلى صور مجهرية غير واضحة للهياكل الفطرية في Festal rubra و Zea mays. سمحت أنماط الاستعمار الفطري باستكشاف كامل لآلية الاستعمار ، وتوفر هذه الطريقة استكشافا عميقا وصغيرا لأنماط واستراتيجيات الاستعمار ل Zea mays و Festuca rubra مع تعبير مرئي إضافي عن معلمات الاستعمار.
في Zea mays ، لوحظت إمكانات استعمار شديدة التقلب اعتمادا على مرحلة نمو النبات ، ومع ذلك ، في Festuca rubra ، تحدث عمليات الاستعمار داخل الجذور وارتبط تطور شبكات hyphal بسرعة تطور منخفضة للجذور. MycoPatt مناسب لرسم خرائط الاستعمار الفطري المفصلي في أي نبات. من المفيد أيضا استكشاف آلية الاستعمار بالكامل وتقييم الاستراتيجية الفطرية على طول الجذور.
