يسمح هذا البروتوكول بالكشف عن نمط إشارات الكالسيوم بين الخلايا الذي يميز استجابة كل نوع خلية في الصحة وكذلك في المرض. تسمح هذه التقنية بالتوصيف الفيزيائي الحيوي السريع والمفصل للسلوك الخلوي المعقد. نحن نخطط لاستخدام إشارات الكالسيوم التي يسببها IgG كبصمة للطب الشخصي للأمراض الالتهابية العصبية.
في بيئة الحياة الواقعية ، ليس من السهل رؤية ومتابعة جميع العمليات والأحداث ، خاصة تلك التي تحدث تحت المجهر. وبالتالي ، فإن البيانات المرئية مهمة. بعد قطع رأس الجراء الذين تتراوح أعمارهم بين يوم وثلاثة أيام ، فضح الجمجمة عن طريق فتح الجلد باستخدام مقص صغير الزاوية.
ثم افتح الجمجمة عن طريق قطع الثقبة العظمى باتجاه المدارات وقم بعمل قطع خط الوسط العمودي. إزالة الدماغ من الجمجمة ، ووضعها في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني. استخدم طرف الملقط لتمزيق الوصلات بين نصفي الكرة الأرضية ، وفصل نصفي الكرة الأرضية بالملقط المنحني عن طريق دفع نصف الكرة برفق من المركز إلى الجانب.
استخدم ملقط مستقيم ومنحني لإزالة السحايا عن طريق تمزيقها بعناية. ثم قم بإزالة الحصين عن طريق قرصه بالملقط المنحني ، وتجاهله ، أو استخدمه لإعداد ثقافة خلية أخرى. بعد ذلك ، انقل القشرة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من PBS البارد وقم بتجانس الأنسجة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من 10 إلى 15 مرة بطرف ملليلتر واحد.
الطرد المركزي للخلايا في 500 غرام لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من PBS البارد عن طريق السحب بطرف ملليلتر واحد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر من DMEM الكامل المكمل بنسبة 10٪ FBS والمضادات الحيوية.
بعد نقل التجانس إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر ، مرر التجانس من خلال إبر قياس 21 و 23 لعمل تعليق للخلايا المفردة. صب تعليق الخلية المحضر من قشرة واحدة في طبق بتري 60 ملم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEM الكامل ، وهز طبق بتري برفق ، بحيث يتم توزيع التعليق بشكل موحد. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الهواء عند 37 درجة مئوية.
لتعزيز نمو الخلايا النجمية ، قم بإزالة الوسائط القديمة ، واغسل الخلية باستخدام PBS الدافئ مسبقا لإزالة الخلايا الدبقية المرتبطة بشكل فضفاض وآثار FBS بمجرد وصولها إلى 70 إلى 80٪ من التقاء. ثم قم بتربسين الطبقة الأساسية من الخلايا النجمية عن طريق إضافة ملليلتر واحد من محلول التربسين الدافئ مسبقا واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. استخدم المجهر للتحقق مما إذا كانت الخلايا تبدأ في الانفصال ، وأضف أربعة ملليلتر من DMEM الكامل.
جمع تعليق الخلية ، ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 500 غرام لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسط الكامل.
عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق الثقافة وإضافة وسط الثقافة. أعد طلاء الخلايا بكثافة من 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع في خمسة ملليلتر من DMEM الكامل الطازج واغسل الخلايا باستخدام DMEM الكامل قبل كل استبدال للوسائط.
بعد الوصول إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، كرر التربسين ، والبذور خمس مرات 10 إلى الخلايا النجمية الثالثة على زلة غطاء زجاجي دائري مطلي ببولي إل ليسين بسبعة ملليمترات. دعهم يعلقون لمدة 10 دقائق ، وأضف DMEM كاملا. استخدمها في التجارب بعد 48 ساعة.
بعد تحضير الثقافات الدبقية الصغيرة ، لتعزيز الخلايا الدبقية الصغيرة ، اسمح للخلايا الدبقية بأن تصبح متقاربة وستظهر الخلايا الدبقية الصغيرة أعلى طبقة الخلايا النجمية بعد 10 إلى 15 يوما. هز طبق بتري على شاكر مداري لمدة ساعتين بسرعة 220 دورة في الدقيقة. الآن ، اغسل برفق الخلايا المنفصلة والمرفقة بشكل فضفاض عن طريق استنشاق الطافية بطرف ماصة سعة ملليلتر.
قم بتوزيع المادة الطافية برفق على طبقة الخلايا عدة مرات ، مما يضمن تغطية سطح طبقة الخلية بالكامل أثناء خطوة الغسيل هذه. جمع الوسط مع الخلايا المنفصلة ، ونقله إلى أنبوب 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي والإنعاش وعد الخلايا كما هو موضح سابقا.
البذور خمس مرات 10 إلى الخلايا الدبقية الصغيرة الثالثة على زلة غطاء زجاجي دائري مطلي ب poly-L-lysine بسبعة ملليمترات. دعهم يعلقون لمدة 10 دقائق وإضافة DMEM كاملة. استخدمها في التجارب بعد 48 ساعة.
لغسل DMEM الكامل ، انقل زلة غطاء واحدة إلى طبق بمحلول خارج الخلية. تحضير محلول تحميل الصبغة عن طريق تخفيف واحد مليمولار Fluo-4 AM بمحلول خارج الخلية لتحقيق التركيز النهائي لخمسة ميكرومولار. ضع زلة الغطاء مع الخلايا في محلول تحميل الصبغة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، واغسل الخلايا في محلول خارج الخلية لمدة 20 دقيقة.
ضع زلة الغطاء في غرفة التسجيل مع ملليلتر واحد من محلول العمل. اختر مجال الرؤية الذي يحتوي على عدد ثابت من الخلايا خلال التجربة. ابدأ التصوير وحدد خط الأساس من خلال الحصول على المستوى الأساسي للتألق لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
ثم أوقف تدفق حل العمل ، وانتقل إلى حل الاختبار لطول الوقت المطلوب. بين كل محلول اختبار ، اغسل الخلايا بتدفق مستمر لمحلول العمل لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. حافظ على حجم المحلول في غرفة التسجيل عند ملليلتر واحد عن طريق ترتيب شفط مستمر من أعلى المحلول.
اختر إطار كثافة الإشارة الأعلى، وقم بتطويق خلية واحدة باستخدام تطبيق أداة المضلع. بعد تطويق جميع الخلايا في الحقل المكتسب ، اختر خمس مناطق ذات أهمية في الخلفية باستخدام أداة الدائرة. ثم قم بقياس متوسط شدة الإشارة لخلية واحدة والخلفية لكل إطار زمني.
حدد جميع مناطق الاهتمام، واستخدم الأمر Multi-Measure في ROI Manager في ImageJ، أو أي أمر مكافئ في البرامج التجارية. بعد استيراد البيانات في برنامج MATLAB ، متوسط خمسة عائد استثمار في الخلفية وطرح متوسط الخلفية لكل إطار من متوسط كثافة عائد الاستثمار للإطارات المكتسبة في وقت واحد. في وقت لاحق ، قم بتحليل نشاط الكالسيوم عن طريق تحديد سعة ذروة الكالسيوم ، والتغيير المتكامل لعابر الكالسيوم ، والوقت إلى الذروة ، ووقت الارتفاع ، ونصف العرض ، والتردد.
يستخدم GFAP لتصور الخلايا النجمية و Iba1 لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة. تستجيب الخلايا النجمية hSOD1G93A للغلوبولين المناعي ALS G بسعة أكبر للكالسيوم العابر ، وتغيير متكامل شامل أكثر أهمية ، ووقت أقصر للذروة من الخلايا النجمية غير المعدلة وراثيا. يمكن تمييز الاستجابة للغلوبولين المناعي ALS G عن الاستجابة ل ATP.
كان لدى الخلايا النجمية hSOD1G93A مستوى أعلى من أيونات الكالسيوم في المخازن كما كشف عن استنفاد المخزن ، مما يشير إلى وجود حمل زائد لهذا الأيون. تم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة ، وتم استخراج متوسط شدة التألق بمرور الوقت. تمثل آثار الكالسيوم لثلاث خلايا أن خلية واحدة فقط استجابت للغلوبولين المناعي ALS G ، بينما استجابت جميع الخلايا ل ATP.
تمثل الصور ذات الألوان الزائفة شدة التألق وخط الأساس استجابة ل ALS و IgG و ATP. يجب تحميل الخلايا بشكل كاف ويجب تعديل معلمات نظام التصوير بشكل مناسب ، بحيث لا يتم فصل الإشارة أثناء التجربة. جنبا إلى جنب مع انبعاث الكالسيوم ، يمكن إجراء لقط التصحيح.
وبالتالي ، يمكن الحصول على صورة أكثر اكتمالا للعلاقة بين التيارات الأيونية الغشائية المختلفة وانبعاث الكالسيوم. يعد فهم توازن الكالسيوم داخل الخلايا ذا أهمية أساسية لاستكشاف العديد من الاستجابات للمنبهات الطبيعية وكذلك للمحفزات الخارجية المجهدة.
