תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

פרוטוקול זה מאפשר לחשוף דפוס איתות סידן בין-תאי המאפיין כל תגובה של סוג תא בבריאות כמו גם במחלה. טכניקה זו מאפשרת אפיון ביופיזי מהיר ומפורט של התנהגות תאית מורכבת. אנו מתכננים להשתמש באיתות סידן זה המושרה על ידי IgG כטביעת אצבע לרפואה מותאמת אישית של מחלות נוירו-דלקתיות.

בסביבה של החיים האמיתיים, לא קל לראות ולעקוב אחר כל התהליכים והאירועים, במיוחד אלה המתרחשים תחת המיקרוסקופ. לפיכך, הנתונים החזותיים חשובים. לאחר עריפת גורים בני יום עד שלושה ימים, חשפו את הגולגולת על ידי חיתוך העור באמצעות מספריים קטנים וזוויתיים.

לאחר מכן פתח את הגולגולת על ידי חיתוך מגנום פורמן לכיוון המסלולים ובצע חתך קו אמצע מאונך. הוציאו את המוח מהגולגולת, והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה PBS. השתמש בקצה המלקחיים כדי לקרוע את הקשרים בין שתי ההמיספרות, והפרד את ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים על ידי דחיפה עדינה של חצי כדור מהמרכז לצד.

השתמשו במלקחיים ישרים ומעוקלים כדי להסיר את קרומי המוח על ידי קריעתם בזהירות. לאחר מכן להסיר את ההיפוקמפוס על ידי צביטה אותו עם מלקחיים מעוקלים, ולהשליך, או להשתמש בו להכנת תרבית תאים אחרת. לאחר מכן, להעביר את קליפת המוח לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של PBS קר הומוגניזציה של הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים עם קצה של מיליליטר אחד.

צנטריפוגה התאים ב 500 גרם במשך חמש דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את הכדור בשלושה מיליליטר של PBS קר על ידי פיפטינג עם קצה של מיליליטר אחד. צנטריפוגה שוב, ולהחזיר את הכדור בשני מיליליטר של DMEM שלם בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה.

לאחר העברת ההומוגנט לצינור של שני מיליליטר, מעבירים את ההומוגנט דרך מחטים של 21 ו-23 כדי לבצע השעיה של תאים בודדים. יוצקים את תרחיף התאים שהוכן מקליפת המוח האחת לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של DMEM שלם, ומנערים קלות את צלחת הפטרי, כך שהמתלה מופץ באופן אחיד. לדגור את התאים באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר ב 37 מעלות צלזיוס.

כדי לקדם את צמיחת האסטרוציטים, הסר את המדיה הישנה, ושטוף את התא עם PBS שחומם מראש כדי להסיר את תאי הגליה המחוברים באופן רופף ואת עקבות ה- FBS ברגע שהם מגיעים למפגש של 70% עד 80%. לאחר מכן נסו את השכבה הבסיסית של האסטרוציטים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין שחוממה מראש ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם התאים מתחילים להתנתק, והוסף ארבעה מיליליטר של DMEM שלם.

לאסוף את ההשעיה התא, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 500 גרם במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולהשהות את הכדור במיליליטר אחד של מדיום שלם.

לספור את התאים באמצעות hemocytometer. לאחר מכן, הכינו את מנת התרבות והוסיפו מדיום תרבותי. סידור מחדש של התאים בצפיפות של 10 עד 4 לסמ"ר בחמישה מיליליטרים של DMEM שלם טרי ושטף את התאים ב-DMEM מלא לפני כל החלפת מדיה.

לאחר הגעה למפגש של 70% עד 80%, חזור על טריפסיניזציה, וזרע חמש פעמים 10 לאסטרוציטים השלישיים על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם לצרף במשך 10 דקות, ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.

לאחר הכנת תרביות המיקרוגליה, כדי לקדם את המיקרוגליה, אפשרו לתאי הגליה להתמזג והמיקרוגליה תופיע על גבי שכבת האסטרוציטים לאחר 10 עד 15 ימים. נערו את צלחת הפטרי על שייקר אורביטלי במשך שעתיים במהירות של 220 סל"ד. כעת, שטפו קלות את התאים המנותקים והמחוברים באופן רופף על ידי שאיפת הסופרנטנט עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד.

יש לטפטף בעדינות את הסופר-נטנט על שכבת התאים מספר פעמים, תוך הקפדה על כיסוי כל משטח שכבת התא במהלך שלב שטיפה זה. לאסוף את המדיום עם תאים מנותקים, ולהעביר אותו צינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה, החייאה וספירת התאים כפי שהוכח קודם לכן.

זרע חמש פעמים 10 למיקרוגליה השלישית על כיסוי זכוכית עגול מצופה פולי-L-ליזין של שבעה מילימטרים. תן להם להתחבר במשך 10 דקות ולהוסיף DMEM שלם. השתמש בהם בניסויים לאחר 48 שעות.

כדי לשטוף את ה-DMEM השלם, העבירו כיסוי אחד לצלחת עם תמיסה חוץ-תאית. הכן את תמיסת העמסת הצבע על ידי דילול מילימולר אחד Fluo-4 AM עם תמיסה חוץ-תאית כדי להשיג את הריכוז הסופי של חמישה מיקרומולר. מניחים את המכסה עם תאים בתמיסת העמסת הצבע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ושוטפים את התאים בתמיסה חוץ-תאית למשך 20 דקות.

הנח את תלוש הכיסוי בתא ההקלטה עם מיליליטר אחד של פתרון עבודה. בחר את שדה הראייה עם מספר עקבי של תאים לאורך כל הניסוי. התחל את ההדמיה וקבע את הבסיס על ידי רכישת הרמה הבסיסית של פלואורסצנציה למשך שלוש עד חמש דקות.

לאחר מכן הפסק את זרימת פתרון העבודה, ועבור לפתרון הבדיקה למשך הזמן הרצוי. בין כל תמיסת בדיקה, לשטוף את התאים עם זרימה קבועה של הפתרון עובד במשך שלוש עד חמש דקות. שמור על עוצמת הקול של התמיסה בתא ההקלטה במיליליטר אחד על ידי סידור יניקה קבועה מראש התמיסה.

בחר במסגרת עוצמת האות הגבוהה ביותר, והקף תא אחד באמצעות יישום הכלי מצולע. לאחר כיתור כל התאים בשדה הנרכש, בחר חמישה אזורי עניין ברקע באמצעות הכלי מעגל. לאחר מכן מדוד את עוצמת האות הממוצעת של תא בודד ואת הרקע עבור כל מסגרת זמן.

בחר את כל אזורי העניין והשתמש בפקודה Multi-Measure ב-ROI Manager ב-ImageJ, או בכל פקודה מקבילה בתוכנה מסחרית. לאחר ייבוא הנתונים בתוכנת MATLAB, ממוצע של חמישה ROI ברקע והפחת את הרקע הממוצע של כל מסגרת מעוצמת ההחזר הממוצעת על ההשקעה של המסגרות שנרכשו בו זמנית. מאוחר יותר, נתחו את פעילות הסידן על ידי קביעת המשרעת של שיא הסידן, השינוי המשולב של ארעי הסידן, זמן לשיא, זמן עלייה, חצי רוחב ותדירות.

GFAP משמש כדי לדמיין אסטרוציטים ו- Iba1 כדי לדמיין microglia. אסטרוציטים hSOD1G93A מגיבים לאימונוגלובולין G של ALS עם משרעת גדולה יותר של הסידן החולף, שינוי משולב כולל משמעותי יותר, וזמן קצר יותר לשיא מאשר אסטרוציטים שאינם מהונדסים. התגובה לאימונוגלובולין G של ALS ניתנת להבחנה מהתגובה ל-ATP.

לאסטרוציטים hSOD1G93A הייתה רמה גבוהה יותר של יוני סידן בחנויות, כפי שהתגלה על ידי דלדול החנות, מה שמעיד על עומס יתר של יון זה. המיקרוגליה עברה תרבית, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת הופקה עם הזמן. עקבות הסידן של שלושה תאים ייצגו שרק תא אחד הגיב לאימונוגלובולין G של ALS, בעוד שכל התאים הגיבו ל-ATP.

התמונות הפסאודו-צבעוניות ייצגו את עוצמת הפלואורסצנציה ואת קו הבסיס בתגובה ל-ALS, IgG ו-ATP. התאים צריכים להיות נטענים כראוי ואת הפרמטרים של מערכת ההדמיה צריך להיות מותאם כראוי, כך האות לא מופרד במהלך הניסוי. יחד עם פליטת סידן, ניתן לבצע הידוק מדבקה.

לפיכך, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של המתאם בין זרמי יונים שונים של הממברנה לבין פליטת סידן. ההבנה של הומאוסטזיס סידן תוך תאי היא בעלת חשיבות חיונית לחקר מספר תגובות לגירויים טבעיים, כמו גם לגירויים מלחיצים וחיצוניים.