Questo protocollo consente di rivelare il modello di segnalazione intercellulare del calcio che caratterizza la risposta di ciascun tipo di cellula in salute e in malattia. Questa tecnica consente una caratterizzazione biofisica rapida e dettagliata del comportamento cellulare complesso. Abbiamo in programma di utilizzare questa segnalazione di calcio indotta da IgG come impronta digitale per la medicina personalizzata delle malattie neuroinfiammatorie.
Nel contesto della vita reale, non è facile vedere e seguire tutti i processi e gli eventi, specialmente quelli che accadono al microscopio. Quindi, i dati visivi sono importanti. Dopo aver decapitato i cuccioli da uno a tre giorni, esporre il cranio aprendo la pelle con piccole forbici angolate.
Quindi aprire il cranio tagliando il forame magno verso le orbite e fare un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS. Usa la punta della pinza per strappare le connessioni tra entrambi gli emisferi e separa gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.
Utilizzare una pinza dritta e curva per rimuovere le meningi strappandole con cura. Quindi rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva e scartarlo, o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare. Successivamente, trasferire la corteccia in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di PBS freddo e omogeneizzare il tessuto pipettando su e giù da 10 a 15 volte con una punta da un millilitro.
Centrifugare le cellule a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in tre millilitri di PBS freddo mediante pipettaggio con una punta da un millilitro. Centrifugare ancora una volta e risospendere il pellet in due millilitri di DMEM completo integrato con FBS al 10% e antibiotici.
Dopo aver trasferito l'omogenato in un tubo da due millilitri, passare l'omogenato attraverso aghi di calibro 21 e 23 per creare una sospensione di singole cellule. Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente tre millilitri di DMEM completo e agitare leggermente la capsula di Petri, in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita. Incubare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria a 37 gradi Celsius.
Per promuovere la crescita degli astrociti, rimuovere i vecchi mezzi e lavare la cellula con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS una volta raggiunta la confluenza dal 70 all'80%. Quindi tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo un millilitro di soluzione di tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti. Utilizzare un microscopio per verificare se le cellule iniziano a staccarsi e aggiungere quattro millilitri di DMEM completo.
Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare il tubo a 500 g per cinque minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo completo.
Contare le cellule usando un emocitometro. Quindi, preparare il piatto di coltura e aggiungere il terreno di coltura. Riplaccare le celle a una densità da 10 alla quarta cella per centimetro quadrato in cinque millilitri di DMEM completo fresco e lavare le celle con DMEM completo prima di ogni sostituzione del supporto.
Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, ripetere la tripsinizzazione e seminare cinque volte 10 al terzo astrocita su un vetrino circolare rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.
Dopo aver preparato le colture microgliali, per promuovere la microglia, lasciare che le cellule gliali diventino confluenti e la microglia apparirà sopra lo strato di astrociti dopo 10-15 giorni. Agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per due ore a 220 giri/min. Ora, lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il surnatante con una punta di pipetta da un millilitro.
Erogare delicatamente il surnatante sullo strato di cellule più volte, assicurandosi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio. Raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare, risospendere e contare le cellule come dimostrato in precedenza.
Seminare cinque volte 10 alla terza microglia su un sottoveste circolare di vetro rivestito di poli-L-lisina di sette millimetri. Lasciarli attaccare per 10 minuti e aggiungere DMEM completo. Usali negli esperimenti dopo 48 ore.
Per lavare il DMEM completo, trasferire un vetrino di copertura su un piatto con soluzione extracellulare. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo un millimolare Fluo-4 AM con soluzione extracellulare per ottenere la concentrazione finale di cinque micromolari. Posizionare il vetrino di copertura con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e lavare le cellule in soluzione extracellulare per 20 minuti.
Posizionare il foglietto di copertura nella camera di registrazione con un millilitro di soluzione di lavoro. Scegli il campo visivo con un numero consistente di celle durante l'esperimento. Avviare l'imaging e determinare la linea di base acquisendo il livello basale di fluorescenza per tre-cinque minuti.
Quindi interrompere il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di test per il periodo di tempo desiderato. Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per tre-cinque minuti. Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a un millilitro organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione.
Scegliete il fotogramma con intensità di segnale più alta e circondate una cella utilizzando l'applicazione dello strumento Poligonale. Dopo aver circondato tutte le celle nel campo acquisito, scegli cinque aree di interesse in background usando lo strumento Cerchio. Quindi misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ciascun intervallo di tempo.
Selezionare tutte le regioni di interesse e utilizzare il comando Multimisura in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale. Dopo aver importato i dati nel software MATLAB, fai la media di cinque ROI in background e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità ROI media dei fotogrammi acquisiti contemporaneamente. Successivamente, analizza l'attività del calcio determinando l'ampiezza del picco di calcio, il cambiamento integrato del transitorio di calcio, il tempo al picco, il tempo di salita, la mezza larghezza e la frequenza.
GFAP è usato per visualizzare gli astrociti e Iba1 per visualizzare la microglia. Gli astrociti hSOD1G93A rispondono all'immunoglobulina G SLA con una maggiore ampiezza del transitorio di calcio, un cambiamento integrato complessivo più considerevole e un tempo di picco più breve rispetto agli astrociti non transgenici. La risposta alla SLA immunoglobulina G è distinguibile dalla risposta all'ATP.
Gli astrociti hSOD1G93A avevano un livello più elevato di ioni calcio nelle scorte, come rivelato dall'esaurimento delle scorte, indicando un sovraccarico di questo ione. Le microglia sono state coltivate e l'intensità media della fluorescenza è stata estratta nel tempo. Le tracce di calcio di tre cellule rappresentavano che solo una cellula rispondeva all'immunoglobulina G della SLA, mentre tutte le cellule rispondevano all'ATP.
Le immagini pseudo-a colori rappresentavano l'intensità della fluorescenza e la linea di base in risposta a SLA, IgG e ATP. Le celle devono essere adeguatamente caricate e i parametri del sistema di imaging devono essere opportunamente regolati, in modo che il segnale non venga separato durante l'esperimento. Insieme all'emissione di calcio, è possibile eseguire il bloccaggio dei cerotti.
Pertanto, è possibile ottenere un quadro più completo della correlazione tra le diverse correnti ioniche di membrana e l'emissione di calcio. La comprensione dell'omeostasi intracellulare del calcio è di fondamentale importanza per l'esplorazione di diverse risposte a stimoli naturali, stressanti ed esterni.
