Este protocolo permite revelar o padrão de sinalização intercelular de cálcio que caracteriza cada resposta do tipo celular na saúde, bem como na doença. Esta técnica permite a caracterização biofísica rápida e detalhada do comportamento celular complexo. Planejamos usar essa sinalização de cálcio induzida por IgG como uma impressão digital para a medicina personalizada de doenças neuroinflamatórias.
No cenário da vida real, não é fácil ver e acompanhar todos os processos e eventos, especialmente aqueles que acontecem sob o microscópio. Por isso, os dados visuais são importantes. Depois de decapitar filhotes de um a três dias de idade, exponha o crânio cortando a pele usando pequenas tesouras angulares.
Em seguida, abra o crânio cortando o forame magno em direção às órbitas e faça um corte perpendicular da linha média. Remova o cérebro do crânio e coloque-o em uma placa de Petri contendo PBS. Use a ponta da pinça para rasgar as conexões entre os dois hemisférios e separe os hemisférios com pinças curvas empurrando suavemente um hemisfério do centro para o lado.
Use pinças retas e curvas para remover as meninges, rasgando-as cuidadosamente. Em seguida, remova o hipocampo, beliscando-o com pinça curva e descarte, ou use-o para outra preparação de cultura de células. Em seguida, transfira o córtex para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS frio e homogeneize o tecido pipetando para cima e para baixo 10 a 15 vezes com uma ponta de um mililitro.
Centrifugar as células a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em três mililitros de PBS frio pipetando com uma ponta de um mililitro. Centrifugar mais uma vez e ressuspender o pellet em dois mililitros de DMEM completo suplementado com 10% FBS e antibióticos.
Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de dois mililitros, passe o homogeneizado através de agulhas de calibre 21 e 23 para fazer uma suspensão de células únicas. Despeje a suspensão celular preparada a partir de um córtex em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo três mililitros de DMEM completo e agite levemente a placa de Petri, de modo que a suspensão seja uniformemente distribuída. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius.
Para promover o crescimento de astrócitos, remova o meio antigo e lave a célula com PBS pré-aquecido para remover as células gliais frouxamente ligadas e os vestígios de FBS uma vez que atinjam 70 a 80% de confluência. Em seguida, tripsnize a camada subjacente de astrócitos adicionando um mililitro de solução de tripsina pré-aquecida e incube a 37 graus Celsius por dois a cinco minutos. Use um microscópio para verificar se as células começam a se desprender e adicione quatro mililitros de DMEM completo.
Colete a suspensão celular e transfira-a para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar o tubo a 500 g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo.
Conte as células usando um hemocitômetro. Em seguida, prepare o prato de cultura e adicione o meio de cultura. Reemplacar as células a uma densidade de 10 a quartas células por centímetro quadrado em cinco mililitros de DMEM completo fresco e lavar as células com DMEM completo antes de cada substituição do meio.
Depois de atingir 70 a 80% de confluência, repita a tripsinização e semeie cinco vezes 10 aos terceiros astrócitos em uma cobertura de vidro circular revestida de poli-Llisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.
Depois de preparar as culturas microgliais, para promover a micróglia, permita que as células gliais se tornem confluentes e a micróglia aparecerá no topo da camada de astrócitos após 10 a 15 dias. Agite a placa de Petri em um agitador orbital por duas horas a 220 RPM. Agora, lave levemente as células separadas e frouxamente presas, aspirando o sobrenadante com uma ponta de pipeta de um mililitro.
Dispense suavemente o sobrenadante na camada de células várias vezes, garantindo cobrir toda a superfície da camada celular durante esta etapa de lavagem. Colete o meio com as células separadas e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar, ressuspender e contar as células conforme demonstrado anteriormente.
Semeie cinco vezes 10 até a terceira micróglia em uma tampa de vidro circular revestida de poli-L-lisina de sete milímetros. Deixe-os anexar por 10 minutos e adicione DMEM completo. Use-os em experimentos após 48 horas.
Para lavar o DMEM completo, transfira uma folha de cobertura para um prato com solução extracelular. Preparar a solução de carregamento de corante diluindo um milimolar Fluo-4 AM com solução extracelular para atingir a concentração final de cinco micromolares. Coloque a tampa deslizante com células na solução de carregamento do corante por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro e lave as células em solução extracelular por 20 minutos.
Coloque a folha de cobertura na câmara de gravação com um mililitro de solução de trabalho. Escolha o campo de visão com um número consistente de células ao longo do experimento. Inicie a imagem e determine a linha de base adquirindo o nível basal de fluorescência por três a cinco minutos.
Em seguida, pare o fluxo da solução de trabalho e mude para a solução de teste pelo período de tempo desejado. Entre cada solução de ensaio, lavar as células com um fluxo constante da solução de trabalho durante três a cinco minutos. Mantenha o volume da solução na câmara de gravação em um mililitro, organizando uma sucção constante a partir do topo da solução.
Escolha o quadro de intensidade de sinal mais alto e circule uma célula usando o aplicativo da ferramenta Poligonal. Depois de circundar todas as células no campo adquirido, escolha cinco regiões de interesse no plano de fundo usando a ferramenta Círculo. Em seguida, meça a intensidade média do sinal de uma única célula e o fundo para cada período de tempo.
Selecione todas as regiões de interesse e use o comando Multi-Measure no ROI Manager no ImageJ ou qualquer comando equivalente em software comercial. Depois de importar os dados no software MATLAB, faça uma média de cinco ROIs de fundo e subtraia o plano de fundo médio de cada quadro da intensidade média do ROI dos quadros adquiridos simultaneamente. Posteriormente, analise a atividade do cálcio determinando a amplitude do pico de cálcio, a mudança integrada do transiente de cálcio, o tempo de pico, o tempo de subida, a meia largura e a frequência.
GFAP é usado para visualizar astrócitos e Iba1 para visualizar a micróglia. Os astrócitos hSOD1G93A respondem à imunoglobulina G da ELA com maior amplitude do transiente de cálcio, uma alteração global integrada mais considerável e um tempo mais curto para atingir o pico do que os astrócitos não transgênicos. A resposta à imunoglobulina G da ELA é distinguível da resposta à ATP.
Os astrócitos hSOD1G93A apresentaram um maior nível de íons cálcio nos estoques, conforme revelado pela depleção do estoque, indicando uma sobrecarga desse íon. Microglias foram cultivadas e a intensidade média de fluorescência foi extraída ao longo do tempo. Os traços de cálcio de três células representaram que apenas uma célula respondeu à imunoglobulina G da ELA, enquanto todas as células responderam ao ATP.
As imagens pseudocoloridas representaram a intensidade de fluorescência e a linha de base em resposta à ELA, IgG e ATP. As células precisam ser adequadamente carregadas e os parâmetros do sistema de imagem precisam ser ajustados adequadamente, de modo que o sinal não seja separado durante o experimento. Juntamente com a emissão de cálcio, o clampeamento do adesivo pode ser realizado.
Assim, um quadro mais completo da correlação entre diferentes correntes de íons de membrana e emissores de cálcio pode ser obtido. A compreensão da homeostase intracelular do cálcio é de importância essencial para a exploração de diversas respostas a estímulos naturais, bem como a estímulos estressantes e externos.
