Este protocolo permite revelar el patrón de señalización de calcio intercelular que caracteriza la respuesta de cada tipo de célula tanto en la salud como en la enfermedad. Esta técnica permite una caracterización biofísica rápida y detallada del comportamiento celular complejo. Planeamos usar esta señalización de calcio inducida por IgG como una huella digital para la medicina personalizada de enfermedades neuroinflamatorias.
En el entorno de la vida real, no es fácil ver y seguir todos los procesos y eventos, especialmente los que suceden bajo el microscopio. Por lo tanto, los datos visuales son importantes. Después de decapitar a los cachorros de uno a tres días de edad, exponga el cráneo abriendo la piel con pequeñas tijeras en ángulo.
Luego abra el cráneo cortando el foramen magnum hacia las órbitas y haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS. Use la punta de los fórceps para rasgar las conexiones entre ambos hemisferios y separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.
Use fórceps rectos y curvos para extraer las meninges rasgándolas cuidadosamente. Luego retire el hipocampo pellizcándolo con pinzas curvas y deséchelo, o úselo para otra preparación de cultivo celular. A continuación, transfiera la corteza a un tubo de 15 mililitros que contenga tres mililitros de PBS frío y homogeneice el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces con una punta de un mililitro.
Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de PBS frío pipeteando con una punta de un mililitro. Centrifugar una vez más, y resuspender el pellet en dos mililitros de DMEM completo suplementado con 10% FBS y antibióticos.
Después de transferir el homogeneizado a un tubo de dos mililitros, pase el homogeneizado a través de agujas de calibre 21 y 23 para hacer una suspensión de células individuales. Vierta la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga tres mililitros de DMEM completo y agite ligeramente la placa de Petri, de modo que la suspensión se distribuya uniformemente. Incubar las células en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados.
Para promover el crecimiento de astrocitos, retire los medios viejos y lave la célula con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS una vez que alcancen una confluencia del 70 al 80%. Luego tripsinizar la capa subyacente de astrocitos agregando un mililitro de solución de tripsina precalentada e incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos. Use un microscopio para verificar si las células comienzan a desprenderse y agregue cuatro mililitros de DMEM completo.
Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 mililitros. Luego centrifugar el tubo a 500 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio completo.
Contar las células con un hemocitómetro. A continuación, prepare el plato de cultivo y agregue el medio de cultivo. Replaque las células a una densidad de 10 a la cuarta células por centímetro cuadrado en cinco mililitros de DMEM completo fresco y lave las células con DMEM completo antes de cada reemplazo de medios.
Después de alcanzar el 70 al 80% de confluencia, repita la tripsinización y siembre cinco veces 10 a los terceros astrocitos en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Deje que se adhieran durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.
Después de preparar los cultivos microgliales, para promover la microglía, permita que las células gliales se confluenten y la microglía aparecerá en la parte superior de la capa de astrocitos después de 10 a 15 días. Agite la placa de Petri en un agitador orbital durante dos horas a 220 RPM. Ahora, lave ligeramente las células separadas y sueltas aspirando el sobrenadante con una punta de pipeta de un mililitro.
Dispense suavemente el sobrenadante sobre la capa de células varias veces, asegurándose de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado. Recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar, resuspender y contar las células como se demostró anteriormente.
Semilla cinco veces 10 a la tercera microglia en un cubrecubierto de vidrio circular recubierto de poli-L-lisina de siete milímetros. Déjelos unidos durante 10 minutos y agregue DMEM completo. Úsalos en experimentos después de 48 horas.
Para lavar el DMEM completo, transfiera una cubierta a un plato con solución extracelular. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo un milimolar Fluo-4 AM con solución extracelular para lograr la concentración final de cinco micromolares. Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, y lave las células en solución extracelular durante 20 minutos.
Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con un mililitro de solución de trabajo. Elija el campo de visión que tenga un número constante de celdas a lo largo del experimento. Comience la imagen y determine la línea de base adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante tres a cinco minutos.
A continuación, detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el tiempo deseado. Entre cada solución de prueba, lave las células con un flujo constante de la solución de trabajo durante tres a cinco minutos. Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación a un mililitro organizando una succión constante desde la parte superior de la solución.
Elija el fotograma de intensidad de señal más alto y rodee una celda con la aplicación de herramienta Poligonal. Después de rodear todas las celdas en el campo adquirido, elija cinco regiones de interés en segundo plano utilizando la herramienta Círculo. Luego mida la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo.
Seleccione todas las regiones de interés y utilice el comando Multi-Measure en ROI Manager en ImageJ, o cualquier comando equivalente en software comercial. Después de importar los datos en el software MATLAB, promedie cinco ROI de fondo y reste el fondo promedio de cada fotograma de la intensidad media del ROI de los fotogramas adquiridos simultáneamente. Más tarde, analice la actividad del calcio determinando la amplitud del pico de calcio, el cambio integrado del transitorio de calcio, el tiempo hasta el pico, el tiempo de subida, el ancho medio y la frecuencia.
GFAP se utiliza para visualizar astrocitos e Iba1 para visualizar microglia. Los astrocitos hSOD1G93A responden a la inmunoglobulina G de ELA con una mayor amplitud del transitorio de calcio, un cambio integrado general más considerable y un tiempo más corto hasta alcanzar el pico que los astrocitos no transgénicos. La respuesta a la inmunoglobulina G de ELA se distingue de la respuesta al ATP.
Los astrocitos hSOD1G93A tenían un mayor nivel de iones de calcio en las reservas como lo revela el agotamiento de la tienda, lo que indica una sobrecarga de este ion. Se cultivaron microglías y se extrajo la intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo. Las trazas de calcio de tres células representaron que solo una célula respondió a la inmunoglobulina G de ELA, mientras que todas las células respondieron al ATP.
Las imágenes pseudo-color representaron la intensidad de fluorescencia y la línea de base en respuesta a ALS, IgG y ATP. Las células deben cargarse adecuadamente y los parámetros del sistema de imágenes deben ajustarse adecuadamente, de modo que la señal no se separe durante el experimento. Junto con la emisión de calcio, se puede realizar un pinzamiento del parche.
Por lo tanto, se puede obtener una imagen más completa de la correlación entre las diferentes corrientes de iones de membrana y las emisoras de calcio. La comprensión de la homeostasis intracelular del calcio es de importancia esencial para la exploración de varias respuestas a estímulos naturales, estresantes y externos.
