تم تصميم هذه البروتوكولات لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش وكذلك نقاء البروتينات من خلال هطول الأمطار القائمة على المذيبات. سنعرض لك بعض الحيل لإجراء هطول الأمطار في القوارير ، بالإضافة إلى نهج شبه آلي بتنسيق خرطوشة دوارة. لقد قمنا أيضا بتحسين بروتوكول هطول الأمطار ليكون متسقا وسريعا.
يستغرق البروتوكول بأكمله بضع دقائق فقط. توضح هذه البروتوكولات أن هطول الأمطار المذيبة للبروتينات مثالي لإعداد العينات قبل قياس الطيف الكتلي. سوف تتناسب البروتوكولات بسلاسة مع سير العمل الاحترافي من أسفل إلى أعلى وكذلك من أعلى إلى أسفل.
سيعرض لنا اليوم زيهنغ دانغ وفيكتوريا ميلر ، كبير العلماء في Proteoform Scientific في هاليفاكس ، نوفا سكوتيا ماصة 90 ميكرولتر من محلول البروتين الخالي من الجسيمات في أنبوب طرد مركزي دقيق من البولي بروبلين. ثم أضف 10 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم المائي الخلد و 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى محلول العينة ، وقم بتغطية القارورة واضغط عليها بلطف لدمج المذيبات. اسمح للقارورة باحتضانها.
درجة حرارة الغرفة دون عائق لمدة لا تقل عن دقيقتين بعد الحضانة ، والطرد المركزي للعينات التي تشير إلى اتجاه القارورة وتدور لمدة دقيقتين على الأقل عند 10،000 RCF أو أعلى في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، لوحظت حبيبة بيضاء مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. عند هذه النقطة، قم بفك غطاء الأنبوب وصب السوبرنات في حاوية نفايات عن طريق عكس الأنبوب.
استخدم منشفة ورقية لسحب أي مذيب متبقي من القارورة. ل SDS التي تحتوي على عينات. استغني بعناية عن 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج دون إزعاج الكريات.
قم بتوسيط العينة على الفور لمدة دقيقة واحدة عند 10،000 مرة من G أو أعلى في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بحساب مذيب الغسيل كما هو موضح سابقا. جفف العينة مع فتح الغطاء لمدة دقيقة واحدة تقريبا.
في غطاء الدخان ، قبل ذوبان الكريات. استغني عن 100 ميكرولتر من محلول البروتين في قارورة من البولي بروبلين. في غطاء الدخان ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول متبوعا ب 100 ميكرولتر من الكلوروفورم.
قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للخلط. قم بتوزيع 300 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. قم بتغطية القارورة واتركها تجلس على سطح المقعد دون إزعاج لمدة دقيقة واحدة ، بعد وضع قارورة البولي بروبيلين في جهاز طرد مركزي وتدويرها لمدة خمس دقائق عند 10،000 مرة من الغرام أو أعلى في درجة حرارة الغرفة.
ويلاحظ أن القارورة تحتوي على طبقتين من المذيبات وحبيبة بيضاء مرئية حتى تصل القارورة إلى حوالي 45 درجة. قم بإزالة ما يقرب من 700 ميكرولتر من المذيب من الطبقة العليا بمعدل موحد باستخدام طرف ماصة صغير كبير بالملليلتر واحد في البداية وبعد ذلك بطرف ماصة 200 ميكرولتر حتى يشكل خرزة في القارورة. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج إلى قارورة العينة دون إزعاج الكريات عن طريق توزيع المذيب على جانب القارورة.
قم بتغطية القارورة ودمج طبقات المذيبات عن طريق هز القارورة بلطف لتدوير المذيبات معا. لمراقبة بيليه البروتين الأبيض مع ملاحظة اتجاه القارورة في جهاز الطرد المركزي الدوار لمدة لا تقل عن 10 دقائق عند 10،000 مرة غرام أو أعلى في درجة حرارة الغرفة. زاوية القارورة مع بيليه متجهة لأسفل.
ضع طرف ماصة على طول الحافة العلوية للقارورة وقم بإزالة السوبرناتانت بطرف ماصة صغير واحد ملليلتر بمعدل بطيء ولكن موحد. الاحتفاظ بحوالي 20 ميكرولتر من المذيبات. اترك المذيب المتبقي ليجف في غطاء الدخان.
لتعجيل البروتين. باستخدام خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها، قم بتوصيل القابس بخرطوشة الترشيح العلوية. الجمع بين 90 ميكرولتر من محلول البروتين 10 ميكرولتر من أكواس الخلد واحد ، كلوريد الصوديوم و 400 ميكرولتر من الأسيتون.
احتضان لمدة لا تقل عن دقيقتين على سطح المقعد ، والطرد المركزي لعينة البروتين المحضرة مع القابس لا يزال متصلا بخرطوشة الترشيح لمدة دقيقتين في 2،500 مرة G.At درجة حرارة الغرفة ، وعكس الخرطوشة وفك وإزالة القابس من قاعدة خرطوشة. ضع خرطوشة الترشيح في جهاز طرد مركزي نظيف لعينة البروتين لمدة ثلاث دقائق عند 500 مرة G في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق من خلال المذيب من القارورة السفلية.
اغسل حبيبات البروتين بإضافة 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى خرطوشة الترشيح ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 500 مرة من G في درجة حرارة الغرفة أو حتى لا يبقى أي مذيب في الخرطوشة العلوية. اتباع بروتوكولات هطول الأمطار البروتين التي سبق إثباتها. إعادة إذابة البروتين عن طريق ترطيب الغشاء في قاعدة خرطوشة الترشيح عن طريق توزيع اثنين إلى خمسة ميكرولترات من بروبانول ISO مباشرة إلى الغشاء مباشرة قبل الشروع في بروتوكول إعادة الذوبان لإعادة إذابة حبيبات البروتين إعداد 80٪ من الحجم حسب الحجم من حمض الفورميك في الماء.
قبل تبريد هذا المحلول الحمضي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر وخرطوشة الترشيح التي تحتوي على البروتين المترسب. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من حمض الفورميك المخفف البارد في غطاء الخرطوشة المبرد والدوامة لمدة 30 ثانية. أعد خرطوشة الترشيح إلى الفريزر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق.
كرر خطوات الدوامة والحضانة السابقة. أضف 450 ميكرولتر من الماء إلى الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر. تخفيف حمض الفورميك إلى 8٪ عكس خرطوشة فك وإزالة القابس من قاعدة خرطوشة وتوصيل خرطوشة SPE إلى قارورة.
قم بتدوير البروتين من خلال خرطوشة SPE في جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 800 مرة G.إذا بقي المذيب في الخرطوشة العلوية ، فقم بإعادة الخرطوشة إلى جهاز الطرد المركزي وكرر الدوران. شطف عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من 5٪ الأسيتونيتريل مع 0.1٪ من TFA في الماء إلى خرطوشة SPE ، والتدفق من خلال خرطوشة SPE لمدة دقيقتين في 2000 مرة G.بالنسبة للبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي أو الببتيدات المهضومة ، قم بإخراج العينة عن طريق تدفق 300 ميكرولتر. A 50٪ acetonitrile مع 0.1٪ من TFA لمدة خمس دقائق في 2 ، 500 مرة G.For البروتينات السليمة.
تابع بخطوة مراوغة إضافية باستخدام 300 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الزهد Trifluoro. الجمع بين اثنين من المستخلصات الناتجة. يقارن الشكل استنفاد SDS بعد القارورة القائمة على البروتينات أو هطول الأمطار في خرطوشة مرشح يمكن التخلص منها.
استخدام الأسيتون مع بروتوكولات السرعة التقليدية وبروتوكولات CMW. تقلل جميع الأساليب من SDS للسماح بالتحليل الأمثل لقياس الطيف الكتلي. يوضح هذا الشكل الاسترداد الكمي للبروتين من خلال اتباع هطول الأمطار السريع للأسيتون وهطول الأمطار CMW من خلال تحليل صفحة SDS لتحليل إجمالي خلية الخميرة المعالجة.
تم الحصول على استرداد متسق مع جميع بروتوكولات هطول الأمطار. يلغي هطول الأمطار في خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها الحاجة إلى ماصة SDS التي تحتوي على supernatant بعناية مع الاحتفاظ بالبروتينات المجمعة فوق مرشح الغشاء. وبالتالي لم يتم الكشف عن أي نطاقات مرئية في الكسور الفائقة عبر ثلاث نسخ متماثلة مستقلة.
يوضح هطول البروتين القائم على الخرطوشة الاسترداد المتفوق لعينة مهضومة من البيبسين من بلازما البقر بالنسبة لهطول الأمطار القائم على القارورة. ولوحظت اختلافات أكثر أهمية في الإنتاجية في الخرطوشة عند استخدام كلوريد الصوديوم أثناء استخدام مذيب الزنك مما أدى إلى أعلى عائد. يحدد هذا الرقم كثافة ذروة الببتيد من كل عينة ببتيد بنسبة أعلى من واحدة تعكس وفرة أعلى من الببتيد للعينات التي تتم معالجتها في خراطيش المرشح التي يمكن التخلص منها.
يقارن الشكل عدد الببتيدات المحددة لكل بروتين عبر مستحضرات العينات الثلاثة المكررة. وتبين معاملات الارتباط من 0.94 إلى 0.95 في هذه الرسوم البيانية الاتساق العالي لنهج إعداد العينات لتحليل مطياف الكتلة من القاعدة إلى القمة. لذلك بمجرد تشكيل هذه الكريات ، فأنت تريد حقا تجنب إزعاجها.
إذا احتفظت بها كحبيبات سليمة ، فستحصل على عائد أعلى. لذا تأكد من عدم نسيان غسل تلك الكريات بالأسيتون الإضافي. هذا هو التأكد من أننا نتخلص من SDS مع الحفاظ على نظافة عينتنا قدر الإمكان وهذا يعطينا أفضل تحليل لقياس الطيف الكتلي.
لذلك وجدنا أن إزالة المذيب الزائد عن طريق عكس العينة أبسط بكثير من محاولة ماصة العينة. ستحصل على عوائد أكثر اتساقا بهذه الطريقة. أدى أداء هطول الأسيتون في درجة حرارة الغرفة إلى استرداد أكثر اتساقا وأسرع من هطول الأمطار التقليدي في الثلاجة.
