Bu protokoller, solvent bazlı çökeltme yoluyla proteinlerin geri kazanımını ve saflığını en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Size şişelerde yağış yapmak için birkaç püf noktası ve ayrıca bir spin kartuşu formatında yarı otomatik bir yaklaşım göstereceğiz. Ayrıca yağış protokolünü tutarlı ve hızlı olacak şekilde optimize ettik.
Tüm protokol sadece birkaç dakika sürer. Bu protokoller, proteinlerin çözücü çökeltilmesinin, kütle spektrometrisinden önce numune hazırlığı için ideal olduğunu göstermektedir. Protokoller, yukarıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya profesyonel iş akışlarına sorunsuz bir şekilde uyacaktır.
Bugün bizim için gösterecek olan Ziheng Dang ve Victoria Miller, Halifax'taki Proteoform Scientific'te Kıdemli Bilim Adamı, Nova Scotia Pipet 90 mikrolitre partikülsüz protein çözeltisini bir polipropilen mikro santrifüj tüpüne dönüştürecek. Daha sonra numune çözeltisine 10 mikrolitre bir mol sulu sodyum klorür ve 400 mikrolitre aseton ekleyin, çözücüleri birleştirmek için şişeyi yavaşça kapatın ve dokunun. Şişenin kuluçkaya yatmasına izin verin.
Kuluçkadan sonra oda sıcaklığı en az iki dakika boyunca bozulmadan, şişenin yönünü belirten numuneleri santrifüj edin ve oda sıcaklığında 10.000 RCF veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az iki dakika boyunca döndürün. Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde görünür beyaz bir pelet gözlenir. Bu noktada, tüpün kapağını açın ve tüpü ters çevirerek süpernatı bir atık kabına boşaltın.
Şişeden kalan çözücüyü çekmek için bir kağıt havlu kullanın. SDS içeren numuneler için. Peleti rahatsız etmeden 400 mikrolitre taze aseton dağıtın.
Numuneyi oda sıcaklığında 10.000 kez G veya daha yüksek bir sıcaklıkta bir dakika boyunca derhal merkezleyin ve şişeyi rotora ilk spinle aynı yönde yerleştirin. Yıkama çözücüsünü daha önce açıklandığı gibi sayın. Numuneyi kapak açıkken yaklaşık bir dakika kurulayın.
Bir duman davlumbazında, bir pelet çözünürlüğünden önce. Protein çözeltisinin 100 mikrolitresini bir polipropilen şişeye dağıtın. Duman davlumbazında, 400 mikrolitre metanol ve ardından 100 mikrolitre kloroform ekleyin.
Şişeyi ve girdabı karıştırmak için kısaca kapatın. 300 mikrolitre suyu doğrudan şişenin merkezine hızlı bir şekilde dağıtın. Şişeyi kapatın ve polipropilen şişeyi bir santrifüje yerleştirdikten sonra bir dakika boyunca rahatsız edilmeden tezgahın üstüne oturmasına izin verin ve oda sıcaklığında 10.000 kat G veya daha yüksek bir sıcaklıkta beş dakika boyunca döndürün.
Flakonun, şişeye kadar yaklaşık 45 derecede iki çözücü tabakasına ve görünür beyaz bir pelet olduğu gözlenmiştir. Başlangıçta ve daha sonra şişede bir boncuk oluşturana kadar 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile bir mililitrelik büyük bir mikro pipet ucu kullanarak çözücüyü üst tabakadan eşit bir oranda çıkarın. Çözücüyü şişenin kenarından aşağı dağıtarak peleti rahatsız etmeden numune şişesine 400 mikrolitre taze metanol ekleyin.
Şişeyi kapatın ve çözücüleri bir araya getirmek için şişeyi hafifçe sallayarak çözücü katmanlarını birleştirin. Rotor santrifüjündeki şişenin yönünü not eden beyaz protein peletini oda sıcaklığında 10.000 kez G veya daha yüksek bir sıcaklıkta en az 10 dakika boyunca gözlemlemek. Şişeyi pelet aşağı bakacak şekilde açın.
Şişenin üst kenarı boyunca bir pipet ucu yerleştirin ve süpernatantı bir mililitrelik mikro pipet ucuyla yavaş ama eşit bir hızda çıkarın. Yaklaşık 20 mikrolitre çözücü tutar. Artık çözücünün duman davlumbazında kurumasına izin verin.
Proteini çökeltmek için. Tek kullanımlık bir filtreleme kartuşu kullanarak fişi üst filtreleme kartuşuna takın. 90 mikrolitre protein çözeltisini 10 mikrolitre bir mol aquas, sodyum klorür ve 400 mikrolitre aseton birleştirin.
Tezgah üstünde en az iki dakika inkübe edin, hazırlanan protein numunesini, oda sıcaklığının 2.500 katında iki dakika boyunca filtrasyon kartuşuna hala bağlı olan G.At santrifüj edin, kartuşu ters çevirin ve fişi kartuş tabanından sökün ve çıkarın. Filtrasyon kartuşunu temiz bir şişeye yerleştirin, protein numunesini oda sıcaklığında 500 kat G'de üç dakika boyunca santrifüj yapın. Çözücü yoluyla akışı alt şişeden atın.
Protein peletini filtrasyon kartuşuna 400 mikrolitre aseton ekleyerek yıkayın, oda sıcaklığında 500 kat G'de veya üst kartuşta çözücü kalmayana kadar üç dakika boyunca santrifüj yapın. Daha önce gösterilen protein çökeltme protokollerini takiben. Protein peletinin yeniden çözündürülmesi için yeniden çözündürme protokolüne geçmeden hemen önce iki ila beş mikrolitre ISO propanolü, filtrasyon kartuşunun tabanındaki membranı ıslatarak proteini yeniden çözündürün, suda formik asidin hacimce çözeltisi olarak% 80 hacim hazırlayın.
Bu asit çözeltisini eksi 20 santigrat derecede ve çökeltilmiş protein içeren filtrasyon kartuşunu önceden soğutun. 50 mikrolitre soğuk seyreltilmiş formik asidi soğutulmuş kartuş kapağına ve girdabına 30 saniye boyunca dağıtın. Filtreleme kartuşunu 10 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede dondurucuya geri koyun.
Önceki vorteks ve inkübasyon adımlarını tekrarlayın. 500 mikrolitrelik son hacme 450 mikrolitre su ekleyin. Formik asidi %8'e kadar seyreltmek Kartuşun vidasını ters çevirin ve fişi kartuş tabanından çıkarın ve SPE kartuşunu şişeye takın.
Proteini SPE kartuşundan oda sıcaklığında bir santrifüjde beş dakika boyunca 800 kez döndürün G.Üst kartuşta çözücü kalırsa, kartuşu santrifüje geri döndürün ve dönüşü tekrarlayın. SPE kartuşuna su içinde% 0.1 TFA ile% 300 mikrolitre% 5 asetonitril ekleyerek durulayın, SPE kartuşundan 2000 kez iki dakika boyunca akın G.Düşük moleküler ağırlıklı proteinler veya sindirilmiş peptitler için 300 mikrolitre akarak numuneyi süzün. Sağlam proteinler için 2.500 kez G.For beş dakika boyunca TFA'nın% 0.1'i ile% 50 asetonitril.
% 0.1 Trifloro münzevi asit ile 300 mikrolitre% 75 asetonitril kullanarak ek bir elusion adımı ile takip edin. Elde edilen iki özü birleştirin. Şekil, tek kullanımlık bir filtre kartuşundaki proteinlerin şişe bazlı veya çökeltilmesini takiben SDS tükenmesini karşılaştırmaktadır.
Geleneksel hızlı ve CMW protokolleri ile aseton kullanımı. Tüm yaklaşımlar, optimum kütle spektrometresi analizine izin vermek için SDS'yi azaltır. Bu şekil, işlenmiş bir maya toplam hücre lizatının SDS sayfa analizi yoluyla hızlı aseton çökeltmesini ve CMW çökelmesini izleyerek kantitatif protein geri kazanımını göstermektedir.
Tüm yağış protokolleri ile tutarlı iyileşme sağlanmıştır. Tek kullanımlık bir filtrasyon kartuşundaki çöküntü, biriken proteinleri bir membran filtresinin üzerinde tutarken süpernatant içeren SDS'yi dikkatlice pipet etme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece, üç bağımsız replikasyon boyunca süpernatant fraksiyonlarda görünür bantlar tespit edilmedi.
Kartuş bazlı protein çökeltisi, Pepsin sindirilmiş sığır plazması örneğinin flakon bazlı çökelmeye göre üstün geri kazanımını gösterir. Kartuşta sodyum klorür kullanılırken verimdeki daha önemli farklılıklar görülürken, çinko çözücü kullanıldığında en yüksek verimle sonuçlanır. Bu şekil, her bir peptid örneğinden peptid tepe yoğunluğunu, tek kullanımlık filtre kartuşlarında işlenen numuneler için daha yüksek bir peptid bolluğunu yansıtan birin üzerinde bir oranla ölçer.
Şekil, üç replikasyon numune preparatı boyunca protein başına tanımlanmış peptitlerin sayısını karşılaştırmaktadır. Bu grafiklerdeki 0,94 ila 0,95 arasındaki korelasyon katsayıları, aşağıdan yukarıya kütle spektrometresi analizi için numune hazırlama yaklaşımının yüksek tutarlılığını göstermektedir. Yani bu pelet bir kez oluştuğunda, onu rahatsız etmekten gerçekten kaçınmak istersiniz.
Sağlam bir pelet olarak tutarsanız, daha yüksek bir verim elde edersiniz. Bu yüzden bu peleti ekstra asetonla yıkamayı unutmadığınızdan emin olun. Bu, numunemizi mümkün olduğunca temiz tutan SDS'den kurtulduğumuzdan emin olmamızı sağlıyor ve bu da bize en iyi kütle spektrometresi analizini veriyor.
Bu nedenle, fazla çözücüyü ters çevirerek çıkarmanın, numuneyi pipetlemeye çalışmaktan çok daha basit olduğunu bulduk. Bu şekilde daha tutarlı verimler elde edersiniz. Oda sıcaklığında aseton çökeltme gerçekleştirmek, dondurucudaki geleneksel yağıştan daha tutarlı ve daha hızlı iyileşme ile sonuçlandı.
