Ces protocoles sont conçus pour maximiser la récupération ainsi que la pureté des protéines grâce à la précipitation à base de solvants. Nous allons vous montrer quelques astuces pour effectuer la précipitation dans des flacons, ainsi qu’une approche semi-automatisée dans un format de cartouche de spin. Nous avons également optimisé le protocole de précipitations pour qu’il soit cohérent et rapide.
L’ensemble du protocole ne prend que quelques minutes. Ces protocoles démontrent que la précipitation des protéines par solvant est idéale pour la préparation des échantillons avant la spectrométrie de masse. Les protocoles s’intégreront parfaitement dans les flux de travail professionnels ascendants et descendants.
Ziheng Dang et Victoria Miller, scientifique principale chez Proteoform Scientific à Halifax, en Nouvelle-Écosse, feront une démonstration pour nous aujourd’hui Pipeter 90 microlitres de solution protéique sans particules dans un tube microcentrifuge en polypropylène. Ajoutez ensuite 10 microlitres de chlorure de sodium aqueux à une mole et 400 microlitres d’acétone dans la solution échantillon, bouchez et tapotez doucement le flacon pour combiner les solvants. Laissez le flacon l’incuber.
Température ambiante non perturbée pendant au moins deux minutes après l’incubation, centrifuger les échantillons en notant l’orientation du flacon et faire tourner pendant au moins deux minutes à 10 000 FCR ou plus à température ambiante. Après la centrifugation, une pastille blanche visible est observée au fond du tube. À ce stade, décapsulez le tube et décantez le surnate dans un conteneur à déchets en retournant le tube.
Utilisez une serviette en papier pour aspirer tout solvant résiduel du flacon. Pour les FDS contenant des échantillons. Distribuez soigneusement 400 microlitres d’acétone fraîche sans déranger la pastille.
Utiliser immédiatement l’échantillon pendant une minute à 10 000 fois G ou plus à température ambiante en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que la rotation initiale. Décompter le solvant de lavage comme décrit précédemment. Sécher l’échantillon avec le bouchon ouvert pendant environ une minute.
Dans une hotte, avant une solubilisation des granulés. Distribuer 100 microlitres de la solution protéique dans un flacon en polypropylène. Dans la hotte, ajoutez 400 microlitres de méthanol suivis de 100 microlitres de chloroforme.
Boucher brièvement le flacon et le vortex pour mélanger. Distribuez rapidement 300 microlitres d’eau directement au centre du flacon. Boucher le flacon et laisser reposer sur la paillasse sans être dérangé pendant une minute, après avoir placé le flacon en polypropylène dans une centrifugeuse et le faire tourner pendant cinq minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante.
On observe que le flacon a deux couches de solvant et une pastille blanche visible jusqu’au flacon à environ 45 degrés. Retirez environ 700 microlitres du solvant de la couche supérieure à un débit uniforme à l’aide d’une grande pointe de micro-pipette d’un millilitre d’abord et plus tard avec une pointe de pipette de 200 microlitres jusqu’à ce qu’elle forme un cordon dans le flacon. Ajouter 400 microlitres de méthanol frais dans le flacon d’échantillon sans perturber la pastille en distribuant le solvant sur le côté du flacon.
Boucher le flacon et combiner les couches de solvant en secouant doucement le flacon pour agiter les solvants ensemble. Observer la pastille de protéine blanche en notant l’orientation du flacon dans la centrifugeuse du rotor pendant au moins 10 minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante. Inclinez le flacon avec la pastille vers le bas.
Placez un embout de pipette le long du bord supérieur du flacon et retirez le surnageant avec un micro-embout de pipette d’un millilitre à un rythme lent mais uniforme. Retenir environ 20 microlitres de solvant. Laisser sécher le solvant résiduel dans la hotte.
Pour précipiter la protéine. À l’aide d’une cartouche de filtration jetable, fixez le bouchon à la cartouche de filtration supérieure. Combiner 90 microlitres de solution protéique 10 microlitres d’une mole aquas, du chlorure de sodium et 400 microlitres d’acétone.
Incuber pendant au moins deux minutes sur la paillasse, centrifuger l’échantillon de protéines préparées avec le bouchon encore attaché à la cartouche de filtration pendant deux minutes à 2 500 fois G.At température ambiante, retourner la cartouche et dévisser et retirer le bouchon de la base de la cartouche. Placer la cartouche de filtration dans un flacon centrifugeur propre de l’échantillon de protéines pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante. Jetez le solvant d’écoulement du flacon inférieur.
Lavez la pastille de protéine en ajoutant 400 microlitres d’acétone à la cartouche de filtration, centrifugez pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solvant dans la cartouche supérieure. Suivre les protocoles de précipitation des protéines précédemment démontrés. Resolubiliser la protéine en mouillant la membrane à la base de la cartouche de filtration en distribuant deux à cinq microlitres de propanol ISO directement sur la membrane immédiatement avant de procéder au protocole de résolubilisation pour la résolubilisation de la pastille de protéine préparer une solution volumique à 80 % en volume d’acide formique dans l’eau.
Pré-refroidir cette solution acide à moins 20 degrés Celsius et la cartouche de filtration contenant des protéines précipitées. Distribuez 50 microlitres d’acide formique dilué à froid dans le bouchon de la cartouche refroidie et le vortex pendant 30 secondes. Remettre la cartouche de filtration au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Répétez les étapes précédentes du vortex et de l’incubation. Ajouter 450 microlitres d’eau à un volume final de 500 microlitres. Diluer l’acide formique à 8%Dévissez la cartouche, retirez le bouchon de la base de la cartouche et fixez la cartouche SPE au flacon.
Faites tourner la protéine à travers la cartouche SPE dans une centrifugeuse à température ambiante pendant cinq minutes à 800 fois G.Si le solvant reste dans la cartouche supérieure, remettez la cartouche dans la centrifugeuse et répétez l’essorage. Rincer en ajoutant 300 microlitres d’acétonitrile à 5% avec 0,1% de TFA dans l’eau à la cartouche SPE, écouler à travers la cartouche SPE pendant deux minutes à 2000 fois G.Pour les protéines de faible poids moléculaire ou les peptides digérés, éluer l’échantillon en faisant couler 300 microlitres. A 50% d’acétonitrile avec 0,1% de TFA pendant cinq minutes à 2 500 fois G.For protéines intactes.
Poursuivez avec une étape d’élusion supplémentaire en utilisant 300 microlitres d’acétonitrile à 75% avec 0,1% d’acide ascétique trifluoro. Combinez les deux extraits obtenus. La figure compare la déplétion de la SDS après une base de flacon ou la précipitation de protéines dans une cartouche filtrante jetable.
Utilisation de l’acétone avec les protocoles conventionnels rapide et CMW. Toutes les approches réduisent les FDS pour permettre une analyse optimale par spectrométrie de masse. Cette figure montre la récupération quantitative des protéines en suivant la précipitation rapide de l’acétone et la précipitation CMW grâce à l’analyse de page SDS d’un lysat cellulaire total de levure traitée.
Une récupération constante a été obtenue avec tous les protocoles de précipitations. La précipitation dans une cartouche de filtration jetable élimine le besoin de pipeter soigneusement les FDS contenant du surnageant tout en retenant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane. Ainsi, aucune bande visible n’a été détectée dans les fractions surnageantes à travers trois répétitions indépendantes.
La précipitation protéique à base de cartouche démontre une récupération supérieure d’un échantillon de plasma bovin digéré par la pepsine par rapport à la précipitation en flacon. Des différences plus significatives dans le rendement sont notées dans la cartouche lorsque l’utilisation de chlorure de sodium tandis que l’utilisation de solvant de zinc a entraîné le rendement le plus élevé. Cette figure quantifie l’intensité maximale peptidique de chaque échantillon de peptide avec un rapport supérieur à un reflétant une abondance peptidique plus élevée pour les échantillons traités dans les cartouches filtrantes jetables.
La figure compare le nombre de peptides identifiés par protéine dans les trois préparations d’échantillons répliquées. Les coefficients de corrélation de 0,94 à 0,95 dans ces graphiques démontrent la grande cohérence de l’approche de préparation des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse ascendante. Donc, une fois que cette pastille est formée, vous voulez vraiment éviter de la déranger.
Si vous le conservez comme une pastille intacte, vous obtiendrez un rendement plus élevé. Assurez-vous donc de ne pas oublier de laver cette pastille avec de l’acétone supplémentaire. Cela nous permet de nous débarrasser de la FDS en gardant notre échantillon aussi propre que possible et cela nous donne la meilleure analyse de spectrométrie de masse.
Nous avons donc constaté que l’élimination de l’excès de solvant en inversant le est beaucoup plus simple que d’essayer de pipeter l’échantillon. Vous obtiendrez des rendements plus constants de cette façon. La précipitation de l’acétone à température ambiante a permis une récupération plus constante et plus rapide que la précipitation traditionnelle au congélateur.
