Эти протоколы предназначены для максимального восстановления, а также чистоты белков посредством осаждения на основе растворителей. Мы покажем вам пару трюков для выполнения осадков во флаконах, а также полуавтоматический подход в формате спин-картриджа. Мы также оптимизировали протокол осадков, чтобы быть последовательным и быстрым.
Весь протокол занимает всего несколько минут. Эти протоколы демонстрируют, что осаждение белков растворителем идеально подходит для подготовки образцов перед масс-спектрометрией. Протоколы будут легко вписываться как в рабочие процессы снизу вверх, так и сверху вниз.
Сегодня нам продемонстрируют Ziheng Dang и Victoria Miller, старший научный сотрудник Proteoform Scientific в Галифаксе, Новая Шотландия Pipette 90 микролитров раствора белка без частиц в полипропиленовую микроцентрифужную трубку. Затем добавьте 10 микролитров одного моля водного хлорида натрия и 400 микролитров ацетона в образец раствора, колпачок и осторожно постучите флаконом, чтобы соединить растворители. Дайте флакону высиживать его.
Комнатную температуру без помех в течение как минимум двух минут после инкубации центрифугируют образцы, отмечая ориентацию флакона и отжим в течение как минимум двух минут при 10 000 RCF или выше при комнатной температуре. После центрифугирования на дне трубки наблюдается видимая белая гранула. В этот момент открутите трубку и декантируйте супернат в контейнер для отходов, перевернув трубку.
Используйте бумажное полотенце, чтобы извлечь любой остаточный растворитель из флакона. Для SDS, содержащих образцы. Осторожно дозируйте 400 микролитров свежего ацетона, не нарушая гранулу.
Немедленно центрируйте образец в течение одной минуты при 10 000 G или выше при комнатной температуре, поместив флакон в ротор в той же ориентации, что и начальный спин. Рассчитайте промывочный растворитель, как описано выше. Высушите образец с открытым колпачком в течение примерно одной минуты.
В вытяжке, перед гранулированной солюбилизацией. Дозируйте 100 микролитров белкового раствора во флакон с полипропиленом. В вытяжной шкаф добавьте 400 микролитров метанола, а затем 100 микролитров хлороформа.
На короткое время замыкайте флакон и вихрь, чтобы перемешать. Быстро дозируйте 300 микролитров воды непосредственно в центр флакона. Укройте флакон крышкой и дайте ему спокойно постоять на столешнице в течение одной минуты, после поместите флакон с полипропиленом в центрифугу и вращайте его в течение пяти минут при 10 000 G или выше при комнатной температуре.
Флакон имеет два слоя растворителя и видимую белую гранулу до флакона при температуре приблизительно 45 градусов. Удалите приблизительно 700 микролитров растворителя из верхнего слоя с равномерной скоростью, используя сначала большой наконечник микропипетки в один миллилитр, а затем с наконечником пипетки объемом 200 микролитров, пока он не образует шарик во флаконе. Добавьте 400 микролитров свежего метанола во флакон с образцом, не нарушая гранулу, дозируя растворитель вниз по стороне флакона.
Закройте флакон крышкой и соедините слои растворителя, осторожно раскачивая флакон, чтобы закрутить растворители вместе. Наблюдать за белым белком гранулы, отмечая ориентацию флакона в роторной центрифуге в течение минимум 10 минут при 10 000 раз G или выше при комнатной температуре. Угльте флакон гранулой лицом вниз.
Поместите наконечник пипетки вдоль верхнего края флакона и удалите супернатант с помощью одного миллилитра микропипетки с медленной, но равномерной скоростью. Удержание приблизительно 20 микролитров растворителя. Дайте остаточному растворителю высохнуть в вытяжном шкафу.
Для осаждения белка. С помощью одноразового фильтрационного картриджа прикрепите заглушку к верхнему фильтрационному картриджу. Совместите 90 микролитров белкового раствора 10 микролитров одного моля акваса, хлорида натрия и 400 микролитров ацетона.
Инкубируйте в течение как минимум двух минут на столешнице, центрифугируйте подготовленный образец белка с помощью пробки, все еще прикрепленной к фильтрационному картриджу, в течение двух минут при 2 500 раз G.At комнатной температуры, переверните картридж и открутите и извлеките пробку из основания картриджа. Поместите фильтрационный картридж в чистый флакон центрифуги с образцом белка на три минуты при 500 G при комнатной температуре. Отбросьте поток через растворитель из нижнего флакона.
Промыть белковую гранулу, добавив 400 микролитров ацетона в фильтрационный картридж, центрифугировать в течение трех минут при 500 g при комнатной температуре или до тех пор, пока в верхнем картридже не останется растворителя. Следуя ранее продемонстрированным протоколам осаждения белка. Повторно солюбилизируют белок путем смачивания мембраны у основания фильтрационного картриджа путем дозирования от двух до пяти микролитров ISO-пропанола непосредственно на мембрану непосредственно перед переходом к протоколу повторной солюбилизации для повторной солюбилизации белковой гранулы, готовят 80% объем по объему раствор муравьиной кислоты в воде.
Предварительно охладите этот раствор кислоты при минус 20 градусах Цельсия и фильтрующий картридж, содержащий осажденный белок. Дозируйте 50 микролитров холодной разбавленной муравьиной кислоты в охлажденный колпачок картриджа и вихрь в течение 30 секунд. Верните фильтрационный картридж в морозильную камеру при минус 20 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Повторите предыдущие этапы вихря и инкубации. Добавьте 450 микролитров воды к конечному объему 500 микролитров. Разбавляя муравьиную кислоту до 8% Инвертируйте картридж, открутите и извлеките пробку из основания картриджа и прикрепите картридж SPE к флакону.
Раскрутите белок через картридж SPE в центрифуге при комнатной температуре в течение пяти минут при 800 G.Если растворитель остается в верхнем картридже, верните картридж в центрифугу и повторите вращение. Промыть, добавив 300 микролитров 5% ацетонитрила с 0,1% TFA в воде в картридж SPE, пропустить через картридж SPE в течение двух минут при 2000 раз больше G.Для низкомолекулярных белков или переваренных пептидов элюируют образец, протекая 300 микролитров. 50%-ацетонитрил с 0,1% TFA в течение пяти минут в 2,500 г. Для интактных белков.
Затем следует дополнительная стадия элюзии с использованием 300 микролитров 75% ацетонитрила с 0,1% трифтораскетической кислоты. Смешайте два полученных экстракта. На рисунке сравнивается истощение SDS после флакона или осаждения белков в одноразовый фильтрующий картридж.
Использование ацетона с обычными протоколами rapid и CMW. Все подходы снижают SDS, чтобы обеспечить оптимальный масс-спектрометрический анализ. Этот рисунок показывает количественное восстановление белка путем быстрого осаждения ацетона и осаждения CMW с помощью SDS-анализа обработанного дрожжевого общего клеточного лизата.
Последовательное восстановление было получено со всеми протоколами осадков. Осаждение в одноразовом фильтрационном картридже устраняет необходимость осторожной пипетки SDS, содержащей супернатант, сохраняя при этом агрегированные белки над мембранным фильтром. Таким образом, в надводных фракциях не было обнаружено видимых полос в трех независимых репликах.
Осаждение белка на основе картриджа демонстрирует превосходное восстановление переваренного пепсином образца бычьей плазмы по сравнению с осаждением на основе флакона. Более существенные различия в выходе отмечены в картридже при использовании хлорида натрия, в то время как использование растворителя цинка привело к наибольшему выходу. Этот рисунок количественно определяет пиковую интенсивность пептида из каждого образца пептида с соотношением выше единицы, отражающим более высокое содержание пептидов для образцов, обработанных в одноразовых фильтрующих картриджах.
На рисунке сравнивается количество идентифицированных пептидов на белок в трех реплицированных пробоотборниках. Коэффициенты корреляции от 0,94 до 0,95 на этих графиках демонстрируют высокую согласованность подхода к пробоподготовке для масс-спектрометрического анализа снизу вверх. Поэтому, как только эта гранула сформирована, вы действительно хотите не беспокоить ее.
Если вы сохраните его в виде неповрежденной гранулы, вы получите более высокий выход. Поэтому не забудьте промыть эту гранулу дополнительным ацетоном. Это гарантирует, что мы избавляемся от SDS, сохраняя наш образец как можно более чистым, и это дает нам лучший масс-спектрометрический анализ.
Таким образом, мы обнаружили, что удаление избыточного растворителя путем инвертирования намного проще, чем попытка пипетки образца. Таким образом, вы получите более стабильные урожаи. Осаждение ацетона при комнатной температуре привело к более последовательному и быстрому восстановлению, чем традиционное осаждение в морозильной камере.
