Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Rückgewinnung sowie die Reinheit von Proteinen durch lösungsmittelbasierte Fällung zu maximieren. Wir zeigen Ihnen ein paar Tricks zur Durchführung von Fällungen in Fläschchen sowie einen halbautomatischen Ansatz im Spin-Cartridge-Format. Wir haben auch das Niederschlagsprotokoll optimiert, um konsistent und schnell zu sein.
Das gesamte Protokoll dauert nur wenige Minuten. Diese Protokolle zeigen, dass die Lösungsmittelfällung von Proteinen ideal für die Probenvorbereitung vor der Massenspektrometrie ist. Die Protokolle fügen sich nahtlos in Bottom-Up- und Top-Down-Pro-Workflows ein.
Ziheng Dang und Victoria Miller, leitende Wissenschaftlerin bei Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia, werden heute 90 Mikroliter partikelfreie Proteinlösung in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 Mikroliter eines Mols wässriges Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton in die Probenlösung hinzu, verschließen und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Lassen Sie die Durchstechflasche brüten.
Raumtemperatur ungestört für mindestens zwei Minuten nach der Inkubation, zentrifugieren Sie die Proben unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche und drehen Sie mindestens zwei Minuten bei 10.000 RCF oder höher bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird ein sichtbares weißes Pellet am Boden des Röhrchens beobachtet. Lösen Sie an dieser Stelle das Rohr und dekantieren Sie das Supernat in einen Abfallbehälter, indem Sie das Rohr umdrehen.
Verwenden Sie ein Papiertuch, um das restliche Lösungsmittel aus der Durchstechflasche zu ziehen. Für SDB, die Proben enthalten. Dosieren Sie vorsichtig 400 Mikroliter frisches Aceton, ohne das Pellet zu stören.
Die Probe wird sofort eine Minute lang bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zentriert, indem Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie beim ersten Spin in den Rotor legen. Zählen Sie das Waschlösungsmittel wie zuvor beschrieben. Trocknen Sie die Probe bei geöffneter Kappe etwa eine Minute lang.
In einem Abzug vor einer Pelletsolubilisierung. Geben Sie 100 Mikroliter der Proteinlösung in eine Durchstechflasche aus Polypropylen. Fügen Sie im Abzug 400 Mikroliter Methanol hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern Chloroform.
Verschließen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel kurz, um zu mischen. Geben Sie schnell 300 Mikroliter Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche und lassen Sie sie eine Minute lang ungestört auf dem Tisch, nachdem Sie die Durchstechflasche aus Polypropylen in eine Zentrifuge gelegt und fünf Minuten lang bei 10.000 Mal G oder höher bei Raumtemperatur gedreht haben.
Es wird beobachtet, dass die Durchstechflasche zwei Lösungsmittelschichten und ein sichtbares weißes Pellet bis zur Durchstechflasche bei etwa 45 Grad aufweist. Etwa 700 Mikroliter des Lösungsmittels werden mit einer großen Mikropipettenspitze von einem Milliliter und später mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze gleichmäßig aus der oberen Schicht entfernt, bis sie in der Durchstechflasche eine Perle bildet. Fügen Sie 400 Mikroliter frisches Methanol in das Probenfläschchen hinzu, ohne das Pellet zu stören, indem Sie das Lösungsmittel an der Seite des Fläschchens abgeben.
Verschließen Sie die Durchstechflasche und kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln. Zur Beobachtung des weißen Proteinpellets ist die Ausrichtung der Durchstechflasche in der Rotorzentrifuge für mindestens 10 Minuten bei 10.000 mal G oder höher bei Raumtemperatur zu beachten. Winkeln Sie die Durchstechflasche mit dem Pellet nach unten.
Platzieren Sie eine Pipettenspitze am oberen Rand der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipettenspitze von einem Milliliter langsam, aber gleichmäßig. Beibehaltung von ca. 20 Mikrolitern Lösungsmittel. Lassen Sie das restliche Lösungsmittel im Abzug trocknen.
Um das Protein auszufällen. Befestigen Sie den Stecker mit einer Einweg-Filterpatrone an der oberen Filterpatrone. Kombinieren Sie 90 Mikroliter Proteinlösung 10 Mikroliter eines Mol-Aquas, Natriumchlorid und 400 Mikroliter Aceton.
Inkubieren Sie für mindestens zwei Minuten auf dem Tisch, zentrifugieren Sie die vorbereitete Proteinprobe mit dem noch an der Filterpatrone befestigten Stopfen für zwei Minuten bei 2.500 Mal G.At Raumtemperatur, drehen Sie die Patrone um und schrauben Sie den Stopfen von der Kartuschenbasis ab. Legen Sie die Filtrationskartusche in eine saubere Durchstechflasche, zentrifugieren Sie die Proteinprobe für drei Minuten bei 500 mal G bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das durchströmende Lösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche.
Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 Mikroliter Aceton in die Filterpatrone geben, zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 500 mal G bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Patrone verbleibt. Nach den zuvor demonstrierten Proteinfällungsprotokollen. Re solubilisieren Sie das Protein, indem Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche benetzen, indem zwei bis fünf Mikroliter ISO-Propanol direkt auf die Membran gegeben werden, unmittelbar bevor mit dem Re-Solubilisierungsprotokoll zur Resolbilisierung des Proteinpellets fortgefahren wird, und stellen Sie 80% Volumenlösung Ameisensäure in Wasser her.
Diese Säurelösung bei minus 20 Grad Celsius und die Filterkartusche mit gefälltem Protein vorkühlen. Geben Sie 50 Mikroliter kalt verdünnte Ameisensäure in die gekühlte Kartuschenkappe und den Wirbel für 30 Sekunden. Bringen Sie die Filterpatrone für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank.
Wiederholen Sie die vorherigen Wirbel- und Inkubationsschritte. Fügen Sie 450 Mikroliter Wasser zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Ameisensäure auf 8 % verdünnenKehren Sie die Patrone ab, entfernen Sie den Stopfen vom Kartuschenboden, und befestigen Sie die SPE-Patrone an der Durchstechflasche.
Schleudern Sie das Protein durch die SPE-Patrone in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 800 mal G.Wenn Lösungsmittel in der oberen Patrone verbleibt, bringen Sie die Patrone zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie den Spin. Spülen Sie, indem Sie 300 Mikroliter 5% Acetonitril mit 0,1% TFA in Wasser in die SPE-Kartusche geben, zwei Minuten lang mit 2000 mal G durch die SPE-Patrone fließen.Für niedermolekulare Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 Mikroliter fließen. Ein 50%Acetonitril mit 0,1% TFA für fünf Minuten bei 2.500 mal G.Für intakte Proteine.
Anschließend folgt ein zusätzlicher Elusionsschritt mit 300 Mikrolitern 75% Acetonitril mit 0,1% Trifluorasketsäure. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte. Die Abbildung vergleicht die SDS-Erschöpfung nach Fläschchenbasis oder Fällung von Proteinen in einer Einwegfilterkartusche.
Verwendung von Aceton mit den herkömmlichen Schnell- und CMW-Protokollen. Alle Ansätze reduzieren SDS, um eine optimale massenspektrometrische Analyse zu ermöglichen. Diese Abbildung zeigt die quantitative Proteingewinnung nach schneller Acetonfällung und CMW-Fällung durch SDS-Seitenanalyse eines verarbeiteten Hefe-Gesamtzelllysats.
Eine konsistente Erholung wurde mit allen Niederschlagsprotokollen erreicht. Durch die Fällung in einer Einweg-Filterkartusche entfällt die Notwendigkeit, SDS-haltigen Überstand sorgfältig zu pipettieren, während die aggregierten Proteine über einem Membranfilter gehalten werden. Somit wurden keine sichtbaren Banden in den überstehenden Fraktionen über drei unabhängige Replikate nachgewiesen.
Die kartuschenbasierte Proteinfällung zeigt eine überlegene Ausbeute einer Pepsin-verdauten Probe von Rinderplasma im Vergleich zur Fällung auf Fläschchenbasis. Signifikantere Unterschiede in der Ausbeute werden in der Kartusche festgestellt, wenn Natriumchlorid verwendet wird, während die Verwendung von Zinklösungsmittel zu der höchsten Ausbeute führte. Diese Abbildung quantifiziert die Peptidspitzenintensität jeder Peptidprobe mit einem Verhältnis über eins, das eine höhere Peptidhäufigkeit für Proben widerspiegelt, die in den Einwegfilterpatronen verarbeitet werden.
Die Abbildung vergleicht die Anzahl der identifizierten Peptide pro Protein über die drei replizierten Probenvorbereitungen. Die Korrelationskoeffizienten von 0,94 bis 0,95 in diesen Grafiken zeigen die hohe Konsistenz des Probenvorbereitungsansatzes für die Bottom-up-Massenspektrometrie-Analyse. Sobald dieses Pellet gebildet ist, möchten Sie es wirklich vermeiden, es zu stören.
Wenn Sie es als intaktes Pellet behalten, erhalten Sie einen höheren Ertrag. Vergessen Sie also nicht, das Pellet mit zusätzlichem Aceton zu waschen. Dies stellt sicher, dass wir das SDS loswerden, um unsere Probe so sauber wie möglich zu halten, und das gibt uns die beste massenspektrometrische Analyse.
Wir haben also festgestellt, dass das Entfernen des überschüssigen Lösungsmittels durch Invertieren der Probe viel einfacher ist als der Versuch, die Probe zu pipettieren. Auf diese Weise erhalten Sie konstantere Erträge. Die Durchführung der Acetonfällung bei Raumtemperatur führte zu einer gleichmäßigeren und schnelleren Erholung als die herkömmliche Fällung im Gefrierschrank.
