Esses protocolos são projetados para maximizar a recuperação, bem como a pureza das proteínas através da precipitação à base de solventes. Vamos mostrar alguns truques para realizar precipitação em frascos, bem como uma abordagem semi-automatizada em um formato de cartucho de spin. Também otimizamos o protocolo de precipitação para sermos consistentes e rápidos.
Todo o protocolo leva apenas alguns minutos. Esses protocolos demonstram que a precipitação de proteínas solventes é ideal para a preparação de amostras antes da espectrometria de massa. Os protocolos se encaixarão perfeitamente em baixo para cima, bem como saídas de trabalho pro.
Demonstrando para nós hoje serão Ziheng Dang e Victoria Miller, cientista sênior da Proteoform Scientific em Halifax, Nova Scotia Pipette 90 microliters de solução de proteína livre de partículas em um tubo de micro centrífuga de polipropileno. Em seguida, adicione 10 microliters de um cloreto de sódio aquoso mole e 400 microliters de acetona na solução amostral, tampa e toque o frasco suavemente para combinar os solventes. Deixe o frasco incuba-lo.
Temperatura ambiente imperturbável por um mínimo de dois minutos após a incubação, centrifugar as amostras observando a orientação do frasco e girar por um mínimo de dois minutos a 10.000 RCF ou mais alto à temperatura ambiente. Após a centrifugação, uma pelota branca visível é observada na parte inferior do tubo. Neste ponto, descape o tubo e decante o supernato em um recipiente de resíduos invertendo o tubo.
Use uma toalha de papel para retirar qualquer solvente residual do frasco. Para SDS contendo amostras. Dispense cuidadosamente 400 microliters de acetona fresca sem perturbar a pelota.
Imediatamente exime a amostra por um minuto a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente, colocando o frasco no rotor na mesma orientação do giro inicial. Desconta o solvente de lavagem como descrito anteriormente. Seque a amostra com a tampa aberta por aproximadamente um minuto.
Em um capuz de fumaça, antes de uma solubilização de pelotas. Distribua 100 microliters da solução proteica em um frasco de polipropileno. No capô da fumaça, adicione 400 microliters de metanol seguido por 100 microliters de clorofórmio.
Tampe o frasco e o vórtice brevemente para misturar. Distribua rapidamente 300 microliters de água diretamente no centro do frasco. Tampe o frasco e deixe-o sentar no topo do banco sem ser perturbado por um minuto, depois de colocar o frasco de polipropileno em uma centrífuga e gire-o por cinco minutos a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente.
Observa-se que o frasco tenha duas camadas de solvente e uma pelota branca visível até o frasco a aproximadamente 45 graus. Remova aproximadamente 700 microliters do solvente da camada superior a uma taxa uniforme usando uma grande ponta de micro pipeta mililitro inicialmente e posteriormente com uma ponta de pipeta de 200 microliteres até formar uma conta no frasco. Adicione 400 microliters de metanol fresco ao frasco de amostra sem perturbar a pelota, distribuindo o solvente pelo lado do frasco.
Cubra o frasco e misture as camadas de solventes balançando suavemente o frasco para rodar os solventes juntos. Observar a pelota de proteína branca observando a orientação do frasco na centrífuga do rotor por um mínimo de 10 minutos a 10.000 vezes G ou mais a temperatura ambiente. Angueta o frasco com a pelota virada para baixo.
Coloque uma ponta de pipeta ao longo da borda superior do frasco e remova o supernatante com uma ponta de micro pipeta de um mililitro a uma taxa lenta, mas uniforme. Retendo aproximadamente 20 microliters de solvente. Deixe o solvente residual secar no capô da fumaça.
Para precipitar a proteína. Utilizando um cartucho de filtragem descartável, conecte o plugue ao cartucho de filtragem superior. Combine 90 microliters de solução proteica 10 microliters de uma toupeira aquas, cloreto de sódio e 400 microliters de acetona.
Incubar por um mínimo de dois minutos na parte superior do banco, centrifugar a amostra de proteína preparada com o plugue ainda ligado ao cartucho de filtragem por dois minutos a 2.500 vezes G.At temperatura ambiente, inverter o cartucho e desaparafusar e remover o plugue da base do cartucho. Coloque o cartucho de filtragem em uma centrífuga de frasco limpo a amostra de proteína por três minutos a 500 vezes G à temperatura ambiente. Descarte o fluxo através do solvente do frasco inferior.
Lave a pelota de proteína adicionando 400 microliters de acetona ao cartucho de filtragem, centrífuga por três minutos a 500 vezes G à temperatura ambiente ou até que nenhum solvente permaneça no cartucho superior. Seguindo os protocolos de precipitação de proteínas previamente demonstrados. Solubilize a proteína molhando a membrana na base do cartucho de filtragem, distribuindo de dois a cinco microlitadores de propanol ISO diretamente à membrana imediatamente antes de prosseguir para o protocolo de ressubilização para ressubilização da pelota de proteína preparar 80% de volume por solução de volume de ácido fórmico na água.
Pré-esfrie esta solução de ácido a menos 20 graus Celsius e o cartucho de filtragem contendo proteína precipitada. Distribua 50 microliters de ácido fórmico diluído a frio na tampa do cartucho resfriado e vórtice por 30 segundos. Devolva o cartucho de filtragem ao congelador a menos 20 graus Celsius por 10 minutos.
Repita o vórtice anterior e as etapas de incubação. Adicione 450 microliters de água a um volume final de 500 microliters. Diluir o ácido fórmico para 8% Inverter o cartucho desaparafusado e remover o plugue da base do cartucho e fixar o cartucho SPE ao frasco.
Gire a proteína através do cartucho SPE em uma centrífuga à temperatura ambiente por cinco minutos a 800 vezes G.Se o solvente permanecer no cartucho superior, devolva o cartucho à centrífuga e repita o giro. Enxágüe adicionando 300 microlitadores de 5%acetonitrila com 0,1% de TFA em água ao cartucho SPE, flua através do cartucho SPE por dois minutos a 2000 vezes G.Para proteínas de baixo peso molecular ou peptídeos digeridos elute a amostra fluindo 300 microliters. Um acetonitrilo de 50% com 0,1% de TFA por cinco minutos a 2,500 vezes G.Para proteínas intactas.
Acompanhe com um passo adicional de elusão utilizando 300 microlitres de 75% de acetonitrilo com ácido ascético trifluoro de 0,1%. Combine os dois extratos resultantes. A figura compara o esgotamento do SDS após a base de frascos ou precipitação de proteínas em um cartucho de filtro descartável.
Usando acetona com os protocolos convencionais rápidos e CMW. Todas as abordagens reduzem os SDS para permitir a análise ideal de espectrometria de massa. Este número mostra a recuperação quantitativa da proteína, seguindo a precipitação rápida de acetona e precipitação de CMW através da análise de página SDS de um teor celular total de levedura processada.
A recuperação consistente foi obtida com todos os protocolos de precipitação. A precipitação em um cartucho de filtragem descartável elimina a necessidade de pipeta cuidadosamente SDS contendo supernanato, mantendo as proteínas agregadas acima de um filtro de membrana. Assim, não foram detectadas faixas visíveis nas frações supernantes em três réplicas independentes.
A precipitação de proteína baseada em cartucho demonstra uma recuperação superior de uma amostra digerida de pepsina de plasma bovino em relação à precipitação à base de frascos. Diferenças mais significativas no rendimento são notadas no cartucho ao empregar cloreto de sódio enquanto a empregação de solvente de zinco resultou no maior rendimento. Esta figura quantifica a intensidade máxima do peptídeo de cada amostra de peptídeo com uma razão acima de uma refletindo uma maior abundância de peptídeos para amostras processadas nos cartuchos de filtro descartáveis.
A figura compara o número de peptídeos identificados por proteína nas três preparações amostrais de réplica. Os coeficientes de correlação de 0,94 a 0,95 nestes gráficos demonstram a alta consistência da abordagem de preparação da amostra para análise de espectrometria de massa de baixo para cima. Então, uma vez que a pelota é formada você realmente quer evitar perturbá-la.
Se você mantê-lo como uma pelota intacta você terá um rendimento maior. Por isso, certifique-se de não esquecer de lavar essa pelota com acetona extra. Isso é ter certeza de que estamos nos livrando do SDS mantendo nossa amostra o mais limpa possível e isso nos dá a melhor análise de espectrometria de massa.
Então descobrimos que remover o excesso de solvente invertendo o é muito mais simples do que tentar pipeta a amostra. Você terá rendimentos mais consistentes assim. A realização da precipitação de acetona à temperatura ambiente resultou em uma recuperação mais consistente e mais rápida do que a precipitação tradicional no congelador.
