أصبح Cryo-EM تقنية قياسية لتحديد بنية البروتينات ومجمعاتها. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات المتعلقة بكيفية الحصول على مجموعات بيانات Cryo-EM عالية الدقة من مجاهر TEM متوسطة المدى 200 كيلو فولت. يمكن ل Cryo-EM تحديد بنية البروتين في ظروف قريبة من الأصل في محلول لحالات توافقية متعددة وحالات وظيفية في وقت واحد ، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة للتقنيات الهيكلية الأخرى.
يمكن استخدام المعلومات الهيكلية التي تم الحصول عليها لتوضيح الآليات الجزيئية لوظيفة البروتين ، وكذلك لتصميم الأدوية القائمة على الهيكل. على سبيل المثال ، كشف منشور حديث في بنية ألياف الأميلويد عن مواقع ربط متعددة للرباط الحيوي. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، نستخدم العينات القياسية من الأبوفيريتين والبروتيازوم لإظهار الخطوات الحاسمة في الحصول على بيانات Cryo-EM عالية الدقة.
أصبح تشغيل Cryo-TEM أكثر سهولة على مدار السنوات الماضية ، خاصة بسبب إدخال ميزات الأتمتة المتقدمة. ومع ذلك ، بالنسبة للجلسة الأولى ، ننصحك بالحصول على تدريب مع مستخدمين أكثر خبرة. من هناك ، فإن التقدم في هذه التقنية سريع نسبيا.
سيوضح الإجراء أدريان كوه ، وهو عالم تطبيقات كبير في Thermo Fisher Scientific. أدخل شبكات تلقائية في علبة اللودر التلقائي تحت ظروف النيتروجين السائل. أدخل الكاسيت مع شبكات السيارات في كبسولة نقل مبردة بالنيتروجين السائل.
أدخل الكبسولة في المجهر وانقر على زر Dock في واجهة مستخدم المجهر لتحميل الكاسيت من الكبسولة إلى اللودر التلقائي للمجهر. انقر فوق الزر "المخزون" للتحقق من وجود شبكات تلقائية في الكاسيت المحمل. ثم انقر فوق أزرار التحميل وإلغاء التحميل لإدراج الشبكات التلقائية في العمود لتصوير TEM.
حدد علامة التبويب أطلس وانقر على زر جلسة جديدة لفتح جلسة جديدة. املأ التفاصيل مثل اسم الجلسة وموقع تخزين البيانات وانقر فوق الزر تطبيق. حدد الشبكات ذات الأهمية عن طريق تحديد خانة اختيار بجوار رقم الشبكة المقابل.
انقر فوق الزر ابدأ لبدء مجموعة مؤتمتة بالكامل من أطالس جميع الشبكات المحددة. عند اكتمال المجموعة ، انقر فوق ملصقات الشبكة لمراجعة الأطالس المكتسبة. حدد علامة التبويب EPU وانتقل إلى جلسة جديدة لإنشاء جلسة جديدة في اللوحة اليمنى.
حدد خيار جلسة عمل جديدة لاستخدام الإعدادات البصرية المسبقة الحالية المحددة. املأ اسم الجلسة. حدد النوع اليدوي للجلسة للتحكم في تحديد الثقوب الفردية ومربعات الشبكة المحددة لجمع البيانات لاحقا في البروتوكول.
حدد وضع الاكتساب الأسرع لاستخدام تحويل الصور الخالي من الانحراف لجمع البيانات. ثم أدخل الموقع لحفظ البيانات الوصفية. انقر فوق الزر "تطبيق" لإنشاء جلسة جديدة.
حدد مهمة تحديد المربع في اللوحة اليمنى لإظهار الأطلس الذي تم جمعه للشبكة. حدد مربعات الشبكة باستخدام رقائق دعم سليمة دون تلف ، وثقوب رقيقة من الجليد الزجاجي والرقائق ، وتلوث الجليد البلوري الضئيل في مربع الشبكة والحد الأدنى من تدرج السطوع عبر مربع الشبكة وداخل ثقوب الرقائق الفردية. حدد مربعات الشبكة لجمع البيانات، إما في الأطلس الكامل أو صور التجانب عالية الجودة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع شبكة ذي أهمية واختر مهمة التحديد بأكملها. انقر فوق الزر Auto Eucentric للانتقال تلقائيا إلى مربع الشبكة المحدد الأول. اضبط الارتفاع المتمركز والحصول على صورة مربعة للشبكة للعثور على ثقوب الرقائق.
انقر فوق الزر "البحث عن ثقوب" للعثور على ثقوب الرقائق في الصورة. انقر فوق الزر إزالة الثقوب لإغلاق زر شريط الشبكة لإلغاء تحديد الثقوب بالقرب من أشرطة الشبكة. اضبط الحدود في الرسم البياني للسطوع لمرشح الجليد لإزالة جميع الثقوب ذات الجليد السميك جدا وجميع الثقوب الفارغة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق ثقب في صورة مربع الشبكة وحدد مرحلة نقل إلى مرحلة نقل الموقع هنا. حدد مهمة تعريف القالب في اللوحة اليمنى. انقر فوق الزر "اكتساب" للحصول على صورة كاملة.
اضبط قيم التأخير بعد إزاحة الصورة على 0.5 ثانية والتأخير بعد إزاحة المرحلة على خمس ثوان. انقر فوق الزر "البحث عن ثقب وتوسيطه" لتوسيط ثقب في الصورة. حدد الزر "إضافة منطقة استحواذ" وانقر على الصورة لتحديد الموقع في الحفرة المركزية حيث سيتم التقاط صورة عالية التكبير.
حدد الزر إضافة منطقة تركيز تلقائي وانقر على الصورة لتحديد الموقع على رقاقة الدعم بجوار الفتحة المركزية حيث سيتم تنفيذ التركيز التلقائي للصورة. انقر فوق منطقة الاستحواذ الخضراء لتعيين سلسلة من قيم إلغاء التركيز البؤري في قائمة إلغاء التركيز البؤري في القسم العلوي من نافذة البرنامج. بعد تعيين الإعدادات الخاصة بالتركيز البؤري التلقائي، حدد الخيار بعد التوسيط للتركيز البؤري التلقائي في بداية كل مجموعة AFIS.
اختر الخيار Objective Lens للحصول على تركيز بؤري تلقائي أسرع وتقليل انحراف المرحلة. انقر فوق الزر إعداد جميع المربعات في مهمة تحديد الثقب لتعيين جمع البيانات وجميع مربعات الشبكة المحددة الأخرى تلقائيا وفقا للإعدادات المستخدمة في مربع الشبكة الأول هذا. حدد مهمة تعريف القالب ، واحصل على صورة جديدة ، وانقل المرحلة إلى منطقة نظيفة على رقائق الكربون بالنقر بزر الماوس الأيمن وحدد خيار القائمة نقل المرحلة هنا.
حدد علامة التبويب الوظائف التلقائية. بعد تعيين إلغاء التركيز البؤري والتكرار المطلوبين ، قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للتركيز البؤري التلقائي وانقر فوق زر البدء لتشغيل وظيفة التركيز البؤري التلقائي. حدد مهمة Autostigmate ، وقم بالتبديل إلى الإعداد المسبق ل Thon Ring واضغط على زر البدء .
حدد مهمة Autocoma واضغط على زر البدء ( Start) . نقل المرحلة إلى منطقة بها مربع شبكة مكسور. تأكد من شفافية المساحة من خلال التقاط صورة تركيز بؤري تلقائي واحدة.
افتح واجهة مستخدم Sherpa وحدد تطبيق فلتر الطاقة. انقر فوق الزر "مركز" وخيار "صفر فقدان" لتوسيط شق مرشح الطاقة صفر الخسارة. انقر فوق الزر Tune في خيار isoochmaticity.
انقر على خيار تكبير اللحن وتشوهات اللحن في التشوهات الهندسية واللونية. انتقل إلى علامة التبويب EPU ، وحدد مهمة الاستحواذ التلقائي وانقر فوق الزر "بدء التشغيل" لبدء جمع البيانات المؤتمتة بالكامل. يوضح الشكل شبكات Cryo-EM التي تعرض تدرجا من سمك الجليد على سطح الشبكة.
الشبكات المستبعدة من التحقيق الإضافي هي شبكة سيئة ذات جليد سميك وشبكة منحنية ذات جليد سيئ وتلوث ، في حين أن الشبكات المقبولة هي تلك ذات التدرج الجليدي الجيد والشبكة النموذجية ذات الجليد الرقيق الجيد والتدرج الجليدي الصغير. يوضح الشكل العرض النهائي 3D لخريطة apoferritin Cryo-EM المعاد بناؤها. إن الثبات والتماثل العاليين يجعلانها عينة معيارية مثالية لتصوير Cryo-EM عالي الدقة ومعالجة الصور.
أدى تلميع بايزي ، وتحسين CTF ، وتصحيح كرة Ewald إلى خريطة دقة 1.63 angstrom. يوضح الشكل عرضا مفصلا لخريطة apoferritin Cryo-EM المعاد بناؤها على مستوى السلسلة الجانبية الفردية للأحماض الأمينية. يتم حل كثافة سلاسل جانب الأحماض الأمينية بشكل جيد ويمكن بناء النموذج الذري بشكل لا لبس فيه داخل الخريطة.
تظهر الصورة هنا مجموعتين مختلفتين من البيانات بقيم مختلفة لإلغاء التركيز البؤري تم جمعها من نفس شبكة Cryo-EM مع مربعات شبكة مماثلة مع شق مفتوح بالكامل وشق 10 إلكترون فولت مما يشير إلى أن شق 10 إلكترون فولت يحسن بشكل كبير من تباين الصورة. يوضح الشكل الوارد هنا نظرة عامة على خريطة Cryo-EM البروتيازوم 20S مع وحدات فرعية مجزأة تستخدم كعينة Cryo-EM قياسية. وتمثل طريقة العرض المكبرة مع نموذج ذري مجهز النواة الحفازة المستقرة لمجمع البروتيازوم مع تناظر D7.
يحتوي البروتوكول على خطوتين حاسمتين. الأول ، البحث عن مناطق ذات جليد زجاجي رقيق يحتوي على جزيئات متجانسة. وثانيا، إعداد إضاءة متوازية للحصول على البيانات.
مع إعادة بناء البروتينات عالية الدقة التي تحقق اثنين إلى ثلاثة أنغستروم في الدقة ، فأنت أكثر قدرة على فهم الآليات الجزيئية للمرض وتحسين خيوط الدواء. في السابق ، كان التبلور ضروريا إذا كنت ترغب في دراسة الأساس الهيكلي للظواهر البيولوجية. اليوم مع Cryo-EM ، لم يعد ذلك ضروريا.
وهكذا مع Cryo-EM ، نمكن العلماء من دراسة مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية على المستوى الهيكلي.
