クライオEMは、タンパク質およびその複合体の構造決定のための標準的な技術となっている。このプロトコルでは、ミッドレンジの200kV TEM顕微鏡から高解像度のCryo-EMデータセットを取得する方法のベストプラクティスについて説明します。Cryo-EMは、複数の立体構造状態および機能状態を同時に解決するために、ほぼ天然条件下でタンパク質構造を決定することができるが、これは他の構造技術ではとらえどころのないものである。
得られた構造情報は、タンパク質機能の分子機構の解明や構造に基づく創薬に役立てることができます。例えば、アミロイド線維の構造に関する最近の刊行物は、重要なリガンドの複数の結合部位を明らかにした。しかし、このプロトコルでは、アポフェリチンとプロテアソームの標準サンプルを使用して、高解像度のCryo-EMデータを取得するための重要なステップを実証します。
Cryo-TEMの操作は、特に高度な自動化機能の導入により、ここ数年でより簡単になりました。ただし、最初のセッションでは、より経験豊富なユーザーとのトレーニングを行うことをお勧めします。そこから、技術の進歩は比較的速いです。
この手順を実演するのは、サーモフィッシャーサイエンティフィックのシニアアプリケーションサイエンティストであるエイドリアン・コーです。液体窒素条件下でオートローダーカセットにオートグリッドを挿入します。オートグリッド付きのカセットを液体窒素冷却移送カプセルに挿入します。
さらにカプセルを顕微鏡に挿入し、顕微鏡UIのDockボタンをクリックして、カプセルから顕微鏡のオートローダーにカセットをロードします。[インベントリ]ボタンをクリックして、ロードされたカセット内の自動グリッドの存在を確認します。次に、[ロード]ボタンと[アンロード]ボタンをクリックして、TEMイメージング用の列に自動グリッドを挿入します。
[アトラス]タブを選択し、[新しいセッション]ボタンをクリックして新しいセッションを開きます。セッション名やデータ保存場所などの詳細を入力し、[適用]ボタンをクリックします。対応するグリッド番号の横にあるチェックボックスをオンにして、目的のグリッドを選択します。
[スタート] ボタンをクリックすると、選択したすべてのグリッドのアトラスの完全自動コレクションが開始されます。収集が完了したら、グリッドラベルをクリックして、取得したアトラスを確認します。[EPU]タブを選択し、[新しいセッション]に移動して、左側のパネルに新しいセッションを作成します。
「新規セッション」オプションを選択して、現在の光学式プリセットを使用します。セッション名を入力します。セッションの手動タイプを選択すると、プロトコルの後半でデータ収集用に選択された個々の穴とグリッドの正方形の選択を制御できます。
高速集録モードを選択すると、収差のない画像シフトを使用してデータ収集が行われます。次に、メタデータを保存する場所を入力します。「適用」ボタンをクリックして、新しいセッションを作成します。
左側のパネルで正方形の選択タスクを選択して、収集されたグリッドのアトラスを表示します。損傷のない無傷のサポートホイル、薄いガラス質の氷とホイルの穴、グリッド正方形のごくわずかな結晶氷汚染、グリッド正方形全体および個々のホイル穴内の最小の輝度勾配を持つグリッド正方形を特定します。データ収集用のグリッドの四角形を、完全なアトラスまたは高品質のタイル画像で選択します。
目的のグリッドの正方形を右クリックし、選択タスク全体を選択します。自動ユーセントリックボタンをクリックすると、最初に選択したグリッドの正方形に自動的に移動します。ユーセントリックの高さを調整し、箔穴を見つけるためのグリッド正方形画像を取得します。
[穴を探す]ボタンをクリックして、画像内の箔穴を見つけます。「穴を削除」ボタンをクリックしてグリッドバーボタンを閉じ、グリッドバーの近くの穴の選択を解除します。アイスフィルターの明るさヒストグラムの制限を調整して、氷が厚すぎるすべての穴と空の穴をすべて削除します。
グリッド正方形画像の穴を右クリックし、[ステージを移動] を選択して、ここでステージを移動場所に移動します。左側のパネルでテンプレート定義タスクを選択します。[取得]ボタンをクリックして、画像全体を取得します。
画像シフト後の遅延の値を 0.5 秒、ステージシフト後の遅延の値を 5 秒に設定します。「穴を見つけて中央揃え」ボタンをクリックして、画像内の穴を中央に配置します。[取得領域の追加]ボタンを選択し、画像をクリックして、中央の穴で高倍率の画像取得が行われる位置を選択します。
[オートフォーカスエリアの追加]ボタンを選択し、画像をクリックして、画像オートフォーカスが実行される中央の穴の横にあるサポートホイル上の位置を選択します。緑色の取得領域をクリックして、ソフトウェアウィンドウの上部セクションにあるデフォーカスリストに一連のデフォーカス値を設定します。オートフォーカス固有の設定を設定した後、各AFISクラスタの開始時にオートフォーカスにセンタリングした後のオプションを選択します。
オプションを選択すると、対物レンズを選択すると、オートフォーカスが速くなり、ステージドリフトが減少します。穴選択タスクの「すべての正方形を準備」ボタンをクリックすると、この最初のグリッド正方形で使用されている設定に従って、データ収集と他のすべての選択したグリッド正方形が自動的に設定されます。テンプレート定義タスクを選択し、新しい画像を取得し、右クリックでステージをカーボンホイル上のクリーンな領域に移動し、メニューオプション[ステージをここに移動]を選択します。
「自動機能」タブを選択します。目的のデフォーカスを設定して反復処理した後、オートフォーカスプリセットに切り替えてスタートボタンをクリックしてオートフォーカス機能を実行します。自動タスクを選択し、トーンリングプリセットに切り替えてスタートボタンを押します。
自動昏睡タスクを選択し、[スタート]ボタンを押します。ステージをグリッドの正方形が壊れている領域に移動します。オートフォーカス画像を1枚撮影して領域の透明度を確認します。
シェルパ UI を開き、エネルギー フィルター アプリケーションを選択します。[中央]ボタンと[ゼロ損失]オプションをクリックして、ゼロ損失エネルギーフィルタスリットを中央に配置します。アイソクロマチシティオプションの[調整]ボタンをクリックします。
幾何学的歪みと色歪みの「倍率を調整」オプションをクリックします。EPUタブに移動し、自動取得タスクを選択し、[実行開始]ボタンをクリックして、完全に自動化されたデータ収集を開始します。この図は、グリッド表面上の氷厚の勾配を表示するクライオEMグリッドを示しています。
さらなる調査から除外されたグリッドは、厚い氷を持つ悪いグリッドと悪い氷と汚染のある曲がったグリッドですが、許容可能なグリッドは、良好な氷勾配を有するグリッドと、良好な薄氷および小さな氷勾配を有する典型的なグリッドである。この図は、再構築されたアポフェリチンCryo-EMマップの最終的な3Dレンダリングを示しています。高い安定性と対称性により、高解像度のCryo-EMイメージングと画像処理に最適なベンチマークサンプルとなります。
ベイズ研磨、CTF 精緻化、およびエワルド球補正により、1.63 オングストローム解像度のマップが得られました。図は、個々のアミノ酸側鎖レベルで再構成されたアポフェリチンCryo−EMマップの詳細図を示す。アミノ酸側鎖の密度はよく分解されており、原子モデルはマップ内で明確に構築することができます。
この画像は、同じCryo-EMグリッドから収集された異なるデフォーカス値の2つの異なるデータセットを示しており、スリットが完全に開いたグリッド正方形と10電子ボルトのスリットがあり、10電子ボルトのスリットが画像コントラストを大幅に改善することを示しています。本明細書の図は、標準的なCryo−EMサンプルとして使用されるセグメント化されたサブユニットを有する20SプロテアソームCryo−EMマップの概要を示す。そして、適合した原子モデルによるズームビューは、D7対称性を持つプロテアソーム複合体の安定した触媒コアを表しています。
このプロトコルには、2 つの重要なステップが含まれています。1つは、均質な粒子を含む薄いガラス質の氷がある領域を探すことです。そして2つ目は、データ集録用の並列照明の設定です。
タンパク質の高解像度再構成により、分解能が2~3オングストロームに達すると、疾患の分子メカニズムをよりよく理解し、薬物リードを改善することができます。以前は、生命現象の構造的基盤を研究したい場合、結晶化が必要でした。今日、Cryo-EMでは、それはもはや必要ありません。
Cryo-EMにより、科学者はより広い範囲の生命現象を構造レベルで研究することができます。
