Крио-ЭМ стал стандартным методом определения структуры белков и их комплексов. Этот протокол описывает лучшие практики получения наборов данных Cryo-EM высокого разрешения из микроскопов среднего класса 200 кВ TEM. Крио-ЭМ может определять структуру белка в близких нативных условиях в растворе для нескольких конформационных состояний и функциональных состояний одновременно, что неуловимо для других структурных методов.
Полученная структурная информация может быть использована для выяснения молекулярных механизмов функции белка, а также для структурного проектирования лекарственных средств. Например, недавняя публикация в структуре амилоидных фибрилл выявила множественные сайты связывания жизненно важного лиганда. Однако в этом протоколе мы используем стандартные образцы апоферритина и протеасомы, чтобы продемонстрировать критические шаги в получении крио-ЭМ данных высокого разрешения.
Эксплуатация Cryo-TEM стала более простой за последние годы, особенно благодаря внедрению передовых функций автоматизации. Тем не менее, для первого сеанса мы бы посоветовали вам пройти обучение с более опытными пользователями. Оттуда прогресс в технике относительно быстрый.
Демонстрировать процедуру будет Адриан Кох, который является старшим научным сотрудником Thermo Fisher Scientific. Вставьте автосетки в кассету автозагрузчика в условиях жидкого азота. Вставьте кассету с автосетками в капсулу с жидкостным азотным охлаждением.
Далее вставьте капсулу в микроскоп и нажмите кнопку Dock в пользовательском интерфейсе микроскопа, чтобы загрузить кассету из капсулы в автоматический загрузчик микроскопа. Нажмите на кнопку Инвентарь, чтобы проверить наличие автосеток в загруженной кассете. Затем нажмите кнопки «Загрузить» и «Выгрузить», чтобы вставить автоматические сетки в столбец для визуализации TEM.
Выберите вкладку Atlas и нажмите кнопку New Session (Новый сеанс), чтобы открыть новый сеанс. Заполните такие сведения, как имя сеанса и место хранения данных, и нажмите кнопку Применить. Выберите интересующие сетки, установив флажок рядом с соответствующим номером сетки.
Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать полностью автоматизированную коллекцию атласов всех выбранных сеток. Когда коллекция будет завершена, нажмите на метки сетки, чтобы просмотреть приобретенные атласы. Выберите вкладку EPU и перейдите в раздел Новый сеанс, чтобы создать новый сеанс на левой панели.
Выберите параметр «Новый сеанс», чтобы использовать текущий набор оптических пресетов. Введите имя сеанса. Выберите ручной тип сеанса, чтобы иметь контроль над выбором отдельных отверстий и квадратов сетки, выбранных для сбора данных позже в протоколе.
Выберите более быстрый режим получения, чтобы использовать сдвиг изображения без аберрации для сбора данных. Затем введите расположение для сохранения метаданных. Нажмите кнопку Применить, чтобы создать новый сеанс.
Выберите задачу выделения квадрата на левой панели, чтобы отобразить собранный атлас сетки. Определите квадраты сетки с неповрежденной опорной фольгой без повреждений, тонким стекловидным льдом и отверстиями из фольги, незначительным загрязнением кристаллического льда в квадрате сетки и минимальным градиентом яркости по квадрату сетки и в отдельных отверстиях фольги. Выберите квадраты сетки для сбора данных либо в полном атласе, либо в высококачественных изображениях плиток.
Щелкните правой кнопкой мыши по интересующему квадрату сетки и выберите всю задачу выбора. Нажмите кнопку Auto Eucentric, чтобы автоматически перейти к первому выбранному квадрату сетки. Отрегулируйте высоту эйцентрика и получите квадратное изображение сетки для поиска отверстий в фольге.
Нажмите на кнопку «Найти отверстия», чтобы найти отверстия в фольге на изображении. Нажмите кнопку «Удалить отверстия», чтобы закрыть кнопку панели сетки, чтобы отменить выделение отверстий рядом с полосами сетки. Отрегулируйте пределы яркости гистограммы ледяного фильтра, чтобы удалить все отверстия со слишком толстым льдом и все пустые отверстия.
Щелкните правой кнопкой мыши отверстие в квадратном изображении сетки и выберите переместить этап в место перемещения этапа здесь. Выберите задачу определения шаблона на левой панели. Нажмите на кнопку «Получить», чтобы получить целое изображение.
Установите значения задержки после сдвига изображения на 0,5 секунды и задержки после сдвига этапа на пять секунд. Нажмите кнопку «Найти и центрировать отверстие», чтобы отцентрировать отверстие на изображении. Нажмите кнопку «Добавить область сбора» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место в центрированном отверстии, где будет происходить получение изображения с большим увеличением.
Нажмите кнопку «Добавить область автофокусировки» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место на опорной фольге рядом с центрированным отверстием, где будет выполняться автофокус изображения. Нажмите на зеленую область сбора, чтобы задать последовательность значений расфокусировки в списке расфокусировки в верхней части окна программного обеспечения. После установки параметров автофокусировки выберите параметр После центрирования, чтобы автофокусироваться в начале каждого кластера AFIS.
Выберите опцию Объектив для более быстрой автофокусировки и уменьшенного дрейфа ступени. Нажмите кнопку «Подготовить все квадраты» в задаче выбора отверстий, чтобы автоматически настроить сбор данных и все другие выбранные квадраты сетки в соответствии с используемыми настройками в этом первом квадрате сетки. Выберите задачу определения шаблона, получите новое изображение, переместите этап в чистую область на углеродной фольге щелчком правой кнопкой мыши и выберите пункт меню переместить этап здесь.
Выберите вкладку Автофункции. После установки нужной расфокусировки и итерации переключитесь на предустановку автофокусировки и нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить функцию автофокусировки. Выберите задачу Autostigmate, переключитесь на предустановку Thon Ring и нажмите кнопку Пуск.
Выберите задачу Автокома и нажмите кнопку Пуск. Перемещение этапа в область с разбитым квадратом сетки. Подтвердите прозрачность области, сделав одно изображение автофокусировки.
Откройте пользовательский интерфейс Sherpa и выберите приложение Energy Filter. Нажмите кнопку «Центр» и опцию «Нулевые потери», чтобы центрировать щель энергетического фильтра с нулевыми потерями. Нажмите кнопку «Настроить» в параметре «Изохроматичность».
Нажмите на опцию Tune Magnification and Tune Distortions в геометрических и хроматических искажениях. Перейдите на вкладку EPU, выберите задачу Автоматическое получение и нажмите кнопку Начать запуск, чтобы начать полностью автоматизированный сбор данных. На рисунке показаны сетки Cryo-EM, отображающие градиент толщины льда над поверхностью сетки.
Сетки, исключенные из дальнейшего исследования, представляют собой плохую сетку с толстым льдом и изогнутой сеткой с плохим льдом и загрязнением, в то время как приемлемыми сетками являются сетки с хорошим градиентом льда и типичной сеткой с хорошим тонким льдом и небольшим градиентом льда. На рисунке показан окончательный 3D-рендеринг реконструированной карты апоферритина Cryo-EM. Высокая стабильность и симметрия делают его оптимальным эталонным образцом для крио-ЭМ визуализации и обработки изображений с высоким разрешением.
Байесовская полировка, уточнение CTF и коррекция сферы Эвальда привели к созданию карты с разрешением 1,63 ангстрема. На рисунке показан детальный вид реконструированной карты крио-ЭМ апоферритина на уровне отдельной аминокислотной боковой цепи. Плотность аминокислотных боковых цепей хорошо разрешена, и атомная модель может быть однозначно построена в пределах карты.
На изображении здесь показаны два разных набора данных с разными значениями расфокусировки, собранные из одной и той же сетки Cryo-EM с аналогичными квадратами сетки с полностью открытой щелью и щелью 10 электрон-вольт, что указывает на то, что щель 10 электрон-вольт значительно улучшает контрастность изображения. На рисунке здесь показан обзор карты крио-ЭМ протеасомы 20S с сегментированными субъединицами, используемыми в качестве стандартного образца Крио-ЭМ. А его увеличенный вид с установленной атомной моделью представляет собой стабильное каталитическое ядро протеасомного комплекса с симметрией D7.
Протокол содержит два критических шага. Во-первых, искать участки с тонким стекловидным льдом, содержащим однородные частицы. И второе, настройка параллельного освещения для сбора данных.
Благодаря реконструкциям белков с высоким разрешением, достигающим двух-трех ангстрем в разрешении, вы сможете лучше понять молекулярные механизмы заболевания и улучшить лекарственные провода. Раньше кристаллизация была необходима, если вы хотели изучить структурные основы биологических явлений. Сегодня с Cryo-EM это больше не нужно.
И поэтому с Cryo-EM мы позволяем ученым изучать более широкий спектр биологических явлений на структурном уровне.
