La cryo-EM est devenue une technique standard pour la détermination de la structure des protéines et de leurs complexes. Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour obtenir des ensembles de données Cryo-EM haute résolution à partir des microscopes TEM 200 kV de milieu de gamme. Cryo-EM peut déterminer la structure des protéines dans des conditions quasi natives en solution pour plusieurs états conformationnels et états fonctionnels simultanément, ce qui est insaisissable pour d’autres techniques structurelles.
Les informations structurelles obtenues peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes moléculaires de la fonction des protéines, ainsi que pour la conception de médicaments basés sur la structure. Par exemple, une publication récente dans la structure des fibrilles amyloïdes a révélé de multiples sites de liaison d’un ligand vital. Cependant, dans ce protocole, nous utilisons les échantillons standard d’apoferritine et de protéasome pour démontrer les étapes critiques de l’obtention de données Cryo-EM à haute résolution.
L’utilisation d’un Cryo-TEM est devenue plus facile au cours des dernières années, notamment grâce à l’introduction de fonctionnalités d’automatisation avancées. Cependant, pour la première session, nous vous conseillons d’avoir une formation avec des utilisateurs plus expérimentés. À partir de là, la progression de la technique est relativement rapide.
La démonstration de la procédure sera assurée par Adrian Koh, scientifique principal en application chez Thermo Fisher Scientific. Insérez des grilles automatiques dans la cassette du chargeur automatique dans des conditions d’azote liquide. Insérez la cassette avec des grilles automatiques dans une capsule de transfert refroidie à l’azote liquide.
Insérez ensuite la capsule dans le microscope et cliquez sur le bouton Dock dans l’interface utilisateur du microscope pour charger la cassette de la capsule dans le chargeur automatique du microscope. Cliquez sur le bouton Inventaire pour vérifier la présence de grilles automatiques dans la cassette chargée. Cliquez ensuite sur les boutons Charger et Décharger pour insérer les grilles automatiques dans la colonne pour l’imagerie TEM.
Sélectionnez l’onglet Atlas et cliquez sur le bouton Nouvelle session pour ouvrir une nouvelle session. Remplissez des détails tels que le nom de la session et l’emplacement de stockage des données et cliquez sur le bouton Appliquer. Sélectionnez les grilles d’intérêt en cochant une case en regard du numéro de grille correspondant.
Cliquez sur le bouton Démarrer pour démarrer une collection entièrement automatisée d’atlas de toutes les grilles sélectionnées. Une fois la collection terminée, cliquez sur les étiquettes de grille pour consulter les atlas acquis. Sélectionnez l’onglet EPU et accédez à Nouvelle session pour créer une nouvelle session dans le panneau de gauche.
Sélectionnez l’option Nouvelle session pour utiliser les préréglages optiques définis actuellement. Renseignez le nom de la session. Sélectionnez le type manuel de la session pour contrôler la sélection des trous individuels et des carrés de grille sélectionnés pour la collecte de données plus tard dans le protocole.
Sélectionnez le mode d’acquisition plus rapide pour utiliser le décalage d’image sans aberration pour la collecte de données. Entrez ensuite l’emplacement pour enregistrer les métadonnées. Cliquez sur le bouton Appliquer pour créer une nouvelle session.
Sélectionnez la tâche de sélection carrée dans le panneau de gauche pour afficher l’atlas collecté de la grille. Identifiez les carrés de la grille avec une feuille de support intacte sans dommage, de la glace vitreuse mince et des trous de feuille, une contamination négligeable de la glace cristalline dans le carré de la grille et un gradient de luminosité minimal à travers le carré de la grille et dans les trous de feuille individuels. Sélectionnez les carrés de grille pour la collecte de données, soit dans l’atlas complet, soit dans des images de tuiles de haute qualité.
Cliquez avec le bouton droit de la souris sur un carré de grille d’intérêt et choisissez l’ensemble de la tâche de sélection. Cliquez sur le bouton Auto Eucentric pour passer automatiquement au premier carré de grille sélectionné. Ajustez la hauteur eucentrique et acquérez une image carrée de grille pour trouver des trous de feuille.
Cliquez sur le bouton Trouver des trous pour trouver des trous de feuille dans l’image. Cliquez sur le bouton Supprimer les trous pour fermer le bouton de la barre de grille afin de désélectionner les trous près des barres de grille. Ajustez les limites dans l’histogramme de luminosité du filtre à glace pour éliminer tous les trous avec de la glace trop épaisse et tous les trous vides.
Cliquez avec le bouton droit de la souris sur un trou dans l’image carrée de la grille et sélectionnez Déplacer l’étape vers l’emplacement déplacer l’étape ici. Sélectionnez la tâche de définition de modèle dans le panneau de gauche. Cliquez sur le bouton Acquérir pour acquérir une image entière.
Définissez les valeurs de délai après le décalage de l’image à 0,5 seconde et de délai après le décalage de l’étape à cinq secondes. Cliquez sur le bouton Rechercher et centrer le trou pour centrer un trou dans l’image. Sélectionnez le bouton Ajouter une zone d’acquisition et cliquez sur l’image pour sélectionner l’emplacement dans le trou centré où l’acquisition d’image à fort grossissement sera prise.
Sélectionnez le bouton Ajouter une zone de mise au point automatique et cliquez sur l’image pour sélectionner l’emplacement sur la feuille de support à côté du trou centré où la mise au point automatique de l’image sera effectuée. Cliquez sur la zone d’acquisition verte pour définir une séquence de valeurs de défocalisation dans la liste de mise au point dans la section supérieure de la fenêtre du logiciel. Après avoir défini les paramètres spécifiques de mise au point automatique, choisissez l’option Après le centrage pour faire le focus automatique au début de chaque cluster AFIS.
Choisissez l’option Objectif objectif pour une mise au point automatique plus rapide et une dérive de scène réduite. Cliquez sur le bouton Préparer tous les carrés dans la tâche de sélection des trous pour définir automatiquement la collecte de données et tous les autres carrés de grille sélectionnés en fonction des paramètres utilisés dans ce premier carré de grille. Sélectionnez la tâche de définition du modèle, acquérez une nouvelle image, déplacez la scène vers une zone propre sur une feuille de carbone en cliquant avec le bouton droit de la souris et sélectionnez l’option de menu Déplacer l’étape ici.
Sélectionnez l’onglet Fonctions automatiques. Après avoir réglé la mise au point et l’itération souhaitées, passez au préréglage de mise au point automatique et cliquez sur le bouton de démarrage pour exécuter la fonction de mise au point automatique. Sélectionnez la tâche Autostigmate, passez au préréglage Thon Ring et appuyez sur le bouton Démarrer.
Sélectionnez la tâche Autocoma et appuyez sur le bouton Démarrer. Déplacez la scène vers une zone avec un carré de grille cassé. Confirmez la transparence de la zone en prenant une seule image de mise au point automatique.
Ouvrez l’interface utilisateur Sherpa et sélectionnez l’application Filtre d’énergie. Cliquez sur le bouton Centre et sur l’option zéro perte pour centrer la fente du filtre à énergie zéro perte. Cliquez sur le bouton Tune dans l’option isochromaticité.
Cliquez sur l’option Tune Magnification et Tune Distortions dans les distorsions géométriques et chromatiques. Accédez à l’onglet EPU, sélectionnez la tâche Acquisition automatisée et cliquez sur le bouton Démarrer l’exécution pour commencer la collecte de données entièrement automatisée. La figure montre des grilles Cryo-EM affichant un gradient d’épaisseur de glace sur la surface de la grille.
Les grilles exclues de l’enquête plus approfondie sont une mauvaise grille avec de la glace épaisse et une grille courbée avec une mauvaise glace et une contamination, tandis que les grilles acceptables sont celles avec un bon gradient de glace et une grille typique avec une bonne glace mince et un petit gradient de glace. La figure montre le rendu 3D final de la carte Cryo-EM de l’apoferritine reconstruite. La stabilité et la symétrie élevées en font un échantillon de référence optimal pour l’imagerie cryo-EM haute résolution et le traitement d’images.
Le polissage bayésien, le raffinement CTF et la correction de la sphère d’Ewald ont abouti à une carte de résolution d’angstrom de 1,63. La figure montre une vue détaillée de la carte Cryo-EM de l’apoferritine reconstruite au niveau de la chaîne latérale des acides aminés individuels. La densité des chaînes latérales d’acides aminés est bien résolue et le modèle atomique peut être construit sans ambiguïté dans la carte.
L’image ici montre deux ensembles de données différents à des valeurs de défocalisation différentes collectées à partir de la même grille Cryo-EM avec des carrés de grille similaires avec une fente entièrement ouverte et une fente de 10 électronvolts qui indique que la fente de 10 électrons-volt améliore considérablement le contraste de l’image. La figure ci-dessous montre un aperçu de la carte Cryo-EM du protéasome 20S avec des sous-unités segmentées utilisées comme échantillon Cryo-EM standard. Et sa vue zoomée avec un modèle atomique ajusté représente le noyau catalytique stable du complexe de protéasomes avec la symétrie D7.
Le protocole contient deux étapes critiques. Premièrement, la recherche de zones avec de la glace vitreuse mince contenant des particules homogènes. Et deuxièmement, la mise en place d’un éclairage parallèle pour l’acquisition de données.
Avec des reconstructions à haute résolution de protéines atteignant deux à trois angströms en résolution, vous êtes mieux en mesure de comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie et d’améliorer les pistes de médicaments. Auparavant, la cristallisation était nécessaire si vous vouliez étudier la base structurelle des phénomènes biologiques. Aujourd’hui, avec Cryo-EM, ce n’est plus nécessaire.
Ainsi, avec Cryo-EM, nous permettons aux scientifiques d’étudier un plus large éventail de phénomènes biologiques au niveau structurel.
