Cryo-EM, proteinlerin ve komplekslerinin yapı tayini için standart bir teknik haline gelmiştir. Bu protokol, orta menzilli 200 kV TEM mikroskoplardan yüksek çözünürlüklü Cryo-EM veri kümelerinin nasıl elde edileceğine ilişkin en iyi uygulamaları açıklar. Cryo-EM, aynı anda çoklu konformasyonel durumlar ve fonksiyonel durumlar için çözelti içinde yakın doğal koşullarda protein yapısını belirleyebilir, bu da diğer yapısal teknikler için zordur.
Elde edilen yapısal bilgiler, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yapı bazlı ilaç tasarımında kullanılabilir. Örneğin, amiloid fibrillerinin yapısındaki yeni bir yayın, hayati bir ligandın çoklu bağlanma bölgelerini ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bu protokolde, yüksek çözünürlüklü Cryo-EM verilerinin elde edilmesindeki kritik adımları göstermek için standart apoferritin ve proteazom örneklerini kullanıyoruz.
Bir Cryo-TEM'in çalıştırılması, özellikle gelişmiş otomasyon özelliklerinin tanıtılması nedeniyle son yıllarda daha kolay hale gelmiştir. Ancak, ilk oturum için, daha deneyimli kullanıcılarla bir eğitim almanızı tavsiye ederiz. Oradan, teknikteki ilerleme nispeten hızlıdır.
Prosedürü gösteren, Thermo Fisher Scientific'te kıdemli bir uygulama bilimcisi olan Adrian Koh olacak. Otomatik ızgaraları sıvı nitrojen koşulları altında otomatik yükleyici kasetine takın. Otomatik ızgaralı kaseti sıvı azot soğutmalı transfer kapsülüne yerleştirin.
Ayrıca kapsülü mikroskopa yerleştirin ve kaseti kapsülden mikroskobun otomatik yükleyicisine yüklemek için mikroskop kullanıcı arayüzündeki Dock düğmesine tıklayın. Yüklenen kasetteki otomatik ızgaraların varlığını kontrol etmek için Envanter düğmesine tıklayın. Ardından, otomatik ızgaraları TEM görüntüleme sütununa eklemek için Yükle ve Kaldır düğmelerine tıklayın.
Atlas sekmesini seçin ve yeni bir oturum açmak için Yeni Oturum düğmesine tıklayın. Oturum adı ve veri depolama konumu gibi ayrıntıları doldurun ve Uygula düğmesine tıklayın. İlgili kılavuz numarasının yanındaki onay kutusunu işaretleyerek ilgilendiğiniz kılavuzları seçin.
Seçilen tüm ızgaraların tam otomatik atlas koleksiyonunu başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Koleksiyon tamamlandığında, alınan atlasları incelemek için ızgara etiketlerine tıklayın. EPU sekmesini seçin ve sol panelde yeni bir oturum oluşturmak için Yeni Oturum'a gidin.
Geçerli ayarlanmış optik hazır ayarları kullanmak için Yeni Oturum seçeneğini belirleyin. Oturum adını girin. Protokolün ilerleyen bölümlerinde veri toplama için seçilen tek tek deliklerin ve ızgara karelerinin seçimi üzerinde denetime sahip olmak için oturumun el ile türünü seçin.
Veri toplama için sapmasız görüntü kaydırmayı kullanmak üzere daha hızlı alma modunu seçin. Ardından, meta verilerin kaydedileceği konumu girin. Yeni bir oturum oluşturmak için Uygula düğmesine tıklayın.
Izgaranın toplanan atlasını göstermek için sol paneldeki kare seçim görevini seçin. Izgara karelerini hasarsız destek folyosu, ince vitreus buzu ve folyo delikleri, ızgara karesinde ihmal edilebilir kristal buz kirliliği ve ızgara karesi boyunca ve bireysel folyo delikleri içinde minimum parlaklık gradyanı ile tanımlayın. Tam atlas veya yüksek kaliteli kutucuk görüntülerinde veri toplama için ızgara karelerini seçin.
İlgilendiğiniz bir ızgara karesine sağ tıklayın ve tüm seçim görevini seçin. Otomatik Ösantrik düğmesine tıklayarak otomatik olarak seçilen ilk ızgara karesine gidin. Ösentrik yüksekliği ayarlayın ve folyo deliklerini bulmak için ızgara kare görüntü elde edin.
Görüntüdeki folyo deliklerini bulmak için Delikleri Bul düğmesine tıklayın. Izgara çubuklarının yakınındaki deliklerin seçimini kaldırmak üzere ızgara çubuğu düğmesini kapatmak için Delikleri Kaldır düğmesine tıklayın. Çok kalın buzlu tüm delikleri ve tüm boş delikleri kaldırmak için buz filtresinin parlaklık histogramındaki sınırları ayarlayın.
Izgara kare görüntüsündeki bir deliğe sağ tıklayın ve burada sahneyi konuma taşı aşamasını seçin. Sol panelde şablon tanımı görevini seçin. Tüm görüntüyü elde etmek için Al düğmesine tıklayın.
Görüntü kaydırma sonrası gecikme değerlerini 0,5 saniyeye ve sahne alanı kaydırma sonrası gecikmeyi beş saniyeye ayarlayın. Görüntüdeki bir deliği ortalamak için Delik Bul ve Ortala düğmesine tıklayın. Alım Alanı Ekle düğmesini seçin ve yüksek büyütmeli görüntü alımının yapılacağı ortalanmış delikteki konumu seçmek için resme tıklayın.
Otomatik Netleme Alanı Ekle düğmesini seçin ve görüntü otomatik odaklamanın gerçekleştirileceği ortalanmış deliğin yanındaki destek folyosundaki konumu seçmek için görüntüye tıklayın. Yazılım penceresinin üst kısmındaki bulanıklaştırma listesinde bir dizi bulanıklaştırma değeri ayarlamak için yeşil Edinme Alanı'na tıklayın. Otomatik netlemeye özgü ayarları yaptıktan sonra, her AFIS kümesinin başında otomatik netlemeyi Ortaladıktan Sonra seçeneğini belirleyin.
Daha hızlı otomatik odaklama ve daha az sahne alanı sürüklenmesi için Hedef Lens seçeneğini belirleyin. Veri toplamayı ve seçilen diğer tüm ızgara karelerini bu ilk ızgara karesinde kullanılan ayarlara göre otomatik olarak ayarlamak için delik seçimi görevindeki Tüm Kareleri Hazırla düğmesine tıklayın. Şablon tanımı görevini seçin, yeni bir görüntü edinin, sağ tıklayarak sahne alanını karbon folyo üzerinde temiz bir alana taşıyın ve sahneyi buraya taşı menü seçeneğini seçin.
Otomatik İşlevler sekmesini seçin. İstediğiniz bulanıklaştırmayı ve yinelemeyi ayarladıktan sonra, otomatik odaklama ön ayarına geçin ve otomatik odaklama işlevini çalıştırmak için Başlat Düğmesine tıklayın. Otomatik Damgalama görevini seçin, Thon Ring hazır ayarına geçin ve Başlat düğmesine basın.
Otomatik Haberleşme görevini seçin ve Başlat düğmesine basın. Sahne alanını bozuk ızgara karesi olan bir alana taşıyın. Tek bir otomatik odaklama görüntüsü alarak alanın saydamlığını onaylayın.
Sherpa UI'yi açın ve Enerji Filtresi uygulamasını seçin. Sıfır kayıp enerji filtresi yarığını ortalamak için Orta düğmesine ve sıfır kayıp seçeneğine tıklayın. İzokromatisite seçeneğindeki Ayarla düğmesine tıklayın.
Geometrik ve kromatik bozulmalarda Ayar Büyütme ve Ayar Bozulmaları seçeneğine tıklayın. EPU sekmesine gidin, Otomatik Edinme görevini seçin ve tam otomatik veri toplamaya başlamak için Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayın. Şekil, ızgara yüzeyi üzerinde buz kalınlığının bir gradyanını gösteren Cryo-EM ızgaralarını göstermektedir.
Daha fazla araştırmadan hariç tutulan ızgaralar, kalın buzlu kötü ızgara ve kötü buz ve kirlenme ile bükülmüş bir ızgara iken, kabul edilebilir ızgaralar iyi buz gradyanına sahip olanlar ve iyi ince buz ve küçük buz gradyanı olan tipik bir ızgaradır. Şekil, yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının son 3D görüntüsünü göstermektedir. Yüksek stabilite ve simetri, onu yüksek çözünürlüklü Cryo-EM görüntüleme ve görüntü işleme için en uygun referans örneği haline getirir.
Bayes parlatma, CTF iyileştirme ve Ewald küre düzeltmesi 1.63 angstrom çözünürlüklü bir harita ile sonuçlandı. Şekil, bireysel amino asit yan zincir seviyesinde yeniden yapılandırılmış apoferritin Cryo-EM haritasının ayrıntılı bir görünümünü göstermektedir. Amino asit yan zincirlerinin yoğunluğu iyi çözülmüştür ve atomik model harita içinde açık bir şekilde inşa edilebilir.
Buradaki görüntü, aynı Cryo-EM ızgarasından toplanan farklı bulanıklaştırma değerlerinde iki farklı veri kümesini, tamamen açık bir yarık ve 10 elektron voltluk bir yarık ile benzer ızgara kareleri ile göstermektedir; bu, 10 elektron voltluk yarığın görüntü kontrastını önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir. Buradaki şekil, standart Cryo-EM örneği olarak kullanılan segmentli alt birimlere sahip 20S proteazom Cryo-EM haritasına genel bir bakış göstermektedir. Ve takılı bir atomik modelle yakınlaştırılmış görünümü, proteazom kompleksinin D7 simetrisine sahip kararlı katalitik çekirdeğini temsil eder.
Protokol iki kritik adım içerir. Birincisi, homojen parçacıklar içeren ince vitreus buzlu alanları aramak. İkincisi, veri toplama için paralel aydınlatmanın kurulması.
Çözünürlükte iki ila üç angstrom elde eden proteinlerin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlarıyla, hastalığın moleküler mekanizmalarını daha iyi anlayabilir ve ilaç kurşunlarını iyileştirebilirsiniz. Önceden, biyolojik olayların yapısal temelini incelemek istiyorsanız kristalleşme gerekliydi. Bugün Cryo-EM ile, bu artık gerekli değil.
Ve böylece Cryo-EM ile, bilim adamlarının yapısal düzeyde daha geniş bir biyolojik fenomen yelpazesini incelemelerini sağlıyoruz.
