Cryo-EM은 단백질과 그 복합체의 구조 결정을위한 표준 기술이되었습니다. 이 프로토콜은 중급 200kV TEM 현미경에서 고해상도 Cryo-EM 데이터 세트를 얻는 모범 사례를 설명합니다. Cryo-EM은 여러 형태 상태 및 기능 상태에 대한 솔루션에서 거의 기본 조건에서 단백질 구조를 동시에 결정할 수 있으며, 이는 다른 구조 기술에서는 어렵습니다.
획득 된 구조 정보는 단백질 기능의 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 구조 기반 약물 설계에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 아밀로이드 피브릴의 구조에 관한 최근의 간행물은 중요한 리간드의 다중 결합 부위를 밝혀냈다. 그러나이 프로토콜에서는 아포페리틴과 프로테아좀의 표준 샘플을 사용하여 고해상도 Cryo-EM 데이터를 얻는 데 중요한 단계를 보여줍니다.
Cryo-TEM의 작동은 특히 고급 자동화 기능의 도입으로 인해 지난 몇 년 동안 더욱 쉬워졌습니다. 그러나 첫 번째 세션에서는 경험이 풍부한 사용자와 함께 교육을받는 것이 좋습니다. 거기에서 기술의 진행은 상대적으로 빠릅니다.
이 절차를 시연하는 것은 Thermo Fisher Scientific의 수석 응용 과학자 인 Adrian Koh입니다. 액체 질소 조건에서 자동 로더 카세트에 자동 그리드를 삽입하십시오. 자동 격자가있는 카세트를 액체 질소 냉각 이송 캡슐에 넣으십시오.
캡슐을 현미경에 더 넣고 현미경 UI의 Dock 버튼을 클릭하여 캡슐에서 현미경의 자동 로더로로드로로드하십시오. 인벤토리 버튼을 클릭하여 로드된 카세트에 자동 그리드가 있는지 확인합니다. 그런 다음 로드 및 언로드 버튼을 클릭하여 TEM 이미징을 위해 자동 격자를 컬럼에 삽입합니다.
Atlas 탭을 선택하고 새 세션 버튼을 클릭하여 새 세션을 엽니다. 세션 이름 및 데이터 저장 위치와 같은 세부 정보를 입력하고 적용 버튼을 클릭하십시오. 해당 격자선 번호 옆에 있는 확인란을 선택하여 관심 격자를 선택합니다.
시작 단추를 클릭하여 선택한 모든 격자의 완전히 자동화된 아틀라스 컬렉션을 시작합니다. 컬렉션이 완료되면 그리드 레이블을 클릭하여 획득한 아틀라스를 검토합니다. EPU 탭을 선택하고 새 세션으로 이동하여 왼쪽 패널에 새 세션을 만듭니다.
새 세션 옵션을 선택하여 현재 설정된 광학 사전 설정을 사용합니다. 세션 이름을 입력합니다. 세션의 수동 유형을 선택하여 프로토콜의 뒷부분에 있는 데이터 수집을 위해 선택된 개별 구멍 및 격자 사각형의 선택을 제어할 수 있습니다.
더 빠른 수집 모드를 선택하여 데이터 수집에 수차 없는 이미지 시프팅을 사용합니다. 그런 다음 메타데이터를 저장할 위치를 입력합니다. 적용 버튼을 클릭하여 새 세션을 만듭니다.
왼쪽 패널에서 사각형 선택 작업을 선택하여 격자의 수집된 아틀라스를 표시합니다. 손상없이 손상되지 않은 지지 호일, 얇은 유리체 얼음 및 호일 구멍, 그리드 사각형의 무시할 수있는 결정질 얼음 오염 및 그리드 사각형과 개별 호일 구멍 내에서 최소한의 밝기 구배로 그리드 사각형을 식별하십시오. 전체 아틀라스 또는 고품질 타일 이미지에서 데이터 수집을 위한 격자 사각형을 선택합니다.
관심있는 격자 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 전체 선택 작업을 선택하십시오. Auto Eucentric 버튼을 클릭하여 첫 번째로 선택한 격자선 사각형으로 자동으로 이동합니다. eucentric 높이를 조정하고 호일 구멍을 찾기 위한 그리드 사각형 이미지를 획득합니다.
구멍 찾기 버튼을 클릭하여 이미지에서 호일 구멍을 찾으십시오. 구멍 제거 단추를 클릭하여 격자 막대 단추를 닫아 격자선 막대 근처의 구멍을 선택 취소합니다. 얼음 필터의 밝기 히스토그램의 한계를 조정하여 너무 두꺼운 얼음과 모든 빈 구멍이있는 모든 구멍을 제거하십시오.
격자 사각형 이미지의 구멍을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스테이지 이동을 선택하여 스테이지 이동 위치를 선택합니다. 왼쪽 패널에서 템플릿 정의 작업을 선택합니다. 획득 버튼을 클릭하여 전체 이미지를 획득하십시오.
이미지 시프트 후 지연 값을 0.5초로 설정하고 스테이지 시프트 후 지연 값을 5초로 설정합니다. 구멍 찾기 및 중앙(Center Hole) 단추를 클릭하여 이미지의 구멍 중앙에 배치합니다. 획득 영역 추가 버튼을 선택하고 이미지를 클릭하여 고배율 이미지 획득을 수행할 중앙 구멍의 위치를 선택합니다.
자동 초점 영역 추가 단추를 선택하고 이미지를 클릭하여 이미지 자동 초점이 수행될 중앙 구멍 옆의 지지 호일의 위치를 선택합니다. 녹색 획득 영역을 클릭하여 소프트웨어 창의 위쪽 섹션에 있는 디포커스 목록에서 디포커스 값의 시퀀스를 설정합니다. 자동 초점 특정 설정을 설정한 후 각 AFIS 클러스터의 시작 부분에서 자동 초점을 맞추려면 센터링 후 옵션을 선택합니다.
더 빠른 자동 초점 조정과 스테이지 드리프트 감소를 위한 대물 렌즈 옵션을 선택하십시오. 구멍 선택 작업에서 모든 사각형 준비 단추를 클릭하여 이 첫 번째 격자선 사각형에서 사용된 설정에 따라 데이터 수집 및 선택한 다른 모든 격자선 사각형을 자동으로 설정합니다. 템플릿 정의 작업을 선택하고, 새 이미지를 획득하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 스테이지를 탄소 호일의 깨끗한 영역으로 이동하고, 메뉴 옵션을 선택하여 스테이지를 여기에서 이동합니다.
자동 기능 탭을 선택합니다. 원하는 초점 해제 및 반복을 설정 한 후 자동 초점 사전 설정으로 전환하고 시작 버튼을 클릭하여 자동 초점 기능을 실행하십시오. 자동 낙인 찍기 작업을 선택하고 Thon Ring 사전 설정으로 전환한 다음 시작 단추를 누릅니다.
Autocoma 작업을 선택하고 시작 단추를 누릅니다. 스테이지를 깨진 격자 사각형이 있는 영역으로 이동합니다. 하나의 자동 초점 이미지를 촬영하여 영역의 투명도를 확인합니다.
Sherpa UI를 열고 에너지 필터 응용 프로그램을 선택합니다. 중심 버튼과 제로 손실 옵션을 클릭하여 제로 손실 에너지 필터 슬릿을 중앙에 맞춥니다. 등색성 옵션에서 조정 버튼을 클릭하십시오.
기하학적 왜곡 및 색채 왜곡에서 배율 조정 및 왜곡 조정 옵션을 클릭합니다. EPU 탭으로 이동하여 자동 수집 작업을 선택한 다음 실행 시작 단추를 클릭하여 완전 자동화된 데이터 수집을 시작합니다. 그림은 그리드 표면에 얼음 두께의 기울기를 표시하는 Cryo-EM 그리드를 보여줍니다.
추가 조사에서 제외 된 그리드는 두꺼운 얼음이있는 불량 그리드와 나쁜 얼음과 오염이있는 구부러진 그리드이며, 허용 가능한 그리드는 좋은 얼음 구배와 좋은 얇은 얼음과 작은 얼음 구배를 가진 전형적인 그리드입니다. 그림은 재구성된 아포페리틴 Cryo-EM 맵의 최종 3D 렌더링을 보여줍니다. 높은 안정성과 대칭성으로 고해상도 Cryo-EM 이미징 및 이미지 처리를 위한 최적의 벤치마크 샘플입니다.
베이지안 연마, CTF 미세화 및 Ewald 구 보정은 1.63 옹스트롬 해상도 맵을 생성했습니다. 도면은 개별 아미노산 측쇄 수준에서 재구성된 아포페리틴 Cryo-EM 맵의 상세한 뷰를 보여준다. 아미노산 측쇄의 밀도는 잘 해결되며 원자 모델은지도 내에서 명확하게 구축 될 수 있습니다.
여기의 이미지는 슬릿이 완전히 열린 유사한 그리드 사각형과 10개의 전자 볼트 슬릿이 이미지 대비를 크게 향상시킨다는 것을 나타내는 10개의 전자 볼트 슬릿을 갖는 동일한 Cryo-EM 그리드에서 수집된 서로 다른 디포커스 값에서 두 개의 서로 다른 데이터 세트를 보여줍니다. 본 명세서의 도면은 표준 Cryo-EM 샘플로서 사용되는 세그먼트화된 서브유닛을 갖는 20S 프로테아좀 Cryo-EM 맵의 개요를 보여준다. 그리고 장착 된 원자 모델을 사용한 확대 된 뷰는 D7 대칭을 가진 프로테아 좀 복합체의 안정적인 촉매 코어를 나타냅니다.
프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 하나는 균질 한 입자를 포함하는 얇은 유리체 얼음이있는 지역을 찾는 것입니다. 둘째, 데이터 수집을 위한 병렬 조명을 설정합니다.
단백질의 고해상도 재구성으로 두 세 개의 옹스트롬을 달성하면 질병의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하고 약물 리드를 개선 할 수 있습니다. 이전에는 생물학적 현상의 구조적 기초를 연구하려는 경우 결정화가 필요했습니다. 오늘날 Cryo-EM에서는 더 이상 필요하지 않습니다.
그래서 Cryo-EM을 통해 과학자들은 구조적 수준에서 더 넓은 범위의 생물학적 현상을 연구 할 수 있습니다.
