Cryo-EM הפכה לטכניקה סטנדרטית לקביעת מבנה של חלבונים והקומפלקסים שלהם. פרוטוקול זה מתאר את שיטות העבודה המומלצות כיצד להשיג מערכי נתונים של Cryo-EM ברזולוציה גבוהה מהמיקרוסקופים הבינוניים של 200 kV TEM. Cryo-EM יכול לקבוע מבנה חלבון בתנאים כמעט מקומיים בתמיסה למצבים קונפורמיים מרובים ומצבים פונקציונליים בו זמנית, וזה חמקמק עבור טכניקות מבניות אחרות.
מידע מבני שהתקבל יכול לשמש להבהרת מנגנונים מולקולריים של תפקוד החלבון, כמו גם לתכנון תרופות מבוססות מבנה. לדוגמה, פרסום שפורסם לאחרונה במבנה של סיבי עמילואיד חשף מספר אתרי קשירה של ליגנד חיוני. עם זאת, בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בדוגמאות הסטנדרטיות של אפופריטין ופרוטאזום כדי להדגים את השלבים הקריטיים בהשגת נתוני Cryo-EM ברזולוציה גבוהה.
הפעלת Cryo-TEM הפכה לקלה יותר בשנים האחרונות, במיוחד בשל הכנסת תכונות אוטומציה מתקדמות. עם זאת, עבור הפגישה הראשונה, אנו ממליצים לך לקבל הדרכה עם משתמשים מנוסים יותר. משם, ההתקדמות בטכניקה מהירה יחסית.
מי שידגים את ההליך יהיה אדריאן קו, שהוא מדען יישומים בכיר בתרמו פישר סיינטיפיק. הכנס רשתות אוטומטיות לתוך קלטת המעמיס האוטומטי בתנאי חנקן נוזלי. הכנס את הקלטת עם רשתות אוטומטיות לתוך קפסולת העברה מקוררת חנקן נוזלי.
בהמשך הכנס את הקפסולה למיקרוסקופ ולחץ על כפתור ה- Dock בממשק המשתמש של המיקרוסקופ כדי לטעון את הקלטת מהקפסולה לתוך המעמיס האוטומטי של המיקרוסקופ. לחץ על הלחצן מלאי כדי לבדוק את הנוכחות של רשתות אוטומטיות בקלטת הטעונה. לאחר מכן לחץ על הלחצנים טען ופרק כדי להוסיף את הרשתות האוטומטיות לעמודה עבור הדמיית TEM.
בחר בכרטיסייה אטלס ולחץ על לחצן הפעלה חדשה כדי לפתוח הפעלה חדשה. מלא פרטים כגון שם ההפעלה ומיקום אחסון הנתונים ולחץ על הלחצן החל. בחר את הרשתות המעניינות על-ידי בחירת תיבת סימון לצד מספר הרשת המתאים.
לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל אוסף אוטומטי לחלוטין של אטלסים של כל הרשתות שנבחרו. לאחר השלמת האוסף, לחץ על תוויות רשת כדי לסקור את האטלסים שנרכשו. בחר בכרטיסייה EPU ועבור אל הפעלה חדשה כדי ליצור הפעלה חדשה בחלונית הימנית.
בחר באפשרות הפעלה חדשה כדי להשתמש בקביעות האופטיות המוגדרות מראש הנוכחיות שהוגדרו. מלא את שם ההפעלה. בחר את הסוג הידני של ההפעלה כדי לקבל שליטה על בחירת חורים וריבועי רשת בודדים שנבחרו לאיסוף נתונים בהמשך הפרוטוקול.
בחר את מצב הרכישה המהיר יותר כדי להשתמש בהסטת תמונות ללא סטייה לאיסוף נתונים. לאחר מכן הזן את המיקום כדי לשמור את המטה-נתונים. לחץ על הלחצן החל כדי ליצור הפעלה חדשה.
בחר את משימת בחירת הריבוע בחלונית השמאלית כדי להציג את האטלס שנאסף של הרשת. זהה את ריבועי הרשת עם רדיד תומך שלם ללא נזק, חורי קרח ונייר כסף דקיקים, זיהום קרח גבישי זניח בריבוע הרשת ושיפוע בהירות מינימלי על פני ריבוע הרשת ובתוך חורי רדיד אלומיניום בודדים. בחר את ריבועי הרשת לאיסוף נתונים, באטלס המלא או בתמונות אריחים באיכות גבוהה.
לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ריבוע רשת מעניין ובחר את כל משימת הבחירה. לחץ על הלחצן Auto Eucentric כדי לעבור באופן אוטומטי לריבוע הרשת הראשון שנבחר. התאם את הגובה האוצנטרי ורכוש תמונה מרובעת רשת למציאת חורי רדיד.
לחץ על כפתור מצא חורים כדי למצוא חורי רדיד בתמונה. לחץ על לחצן הסר חורים כדי לסגור את לחצן סרגל הרשת כדי לבטל את הבחירה בחורים ליד פסי רשת. התאימו את הגבולות בהיסטוגרמה של הבהירות של מסנן הקרח כדי להסיר את כל החורים עם קרח סמיך מדי ואת כל החורים הריקים.
לחץ לחיצה ימנית על חור בתמונה המרובעת של הרשת ובחר הזזת שלב לשלב הזזת מיקום כאן. בחר את משימת הגדרת התבנית בחלונית השמאלית. לחץ על כפתור רכישה כדי להשיג תמונה שלמה.
הגדר ערכים לעיכוב לאחר הזזת התמונה ל- 0.5 שניות והשהה לאחר העברת שלב לחמש שניות. לחץ על הלחצן חיפוש וחור מרכזי כדי למרכז חור בתמונה. בחר בלחצן הוסף אזור רכישה ולחץ על התמונה כדי לבחור את המיקום בחור הממורכז שבו תצולם רכישת תמונה בהגדלה גבוהה.
בחר בלחצן הוסף אזור מיקוד אוטומטי ולחץ על התמונה כדי לבחור את המיקום בנייר הכסף של התמיכה לצד החור הממורכז שבו יבוצע המיקוד האוטומטי של התמונה. לחץ על אזור הרכישה הירוק כדי להגדיר רצף של ערכי defocus ברשימת defocus בחלק העליון של חלון התוכנה. לאחר הגדרת ההגדרות הספציפיות למיקוד אוטומטי, בחר באפשרות לאחר מרכוז למיקוד אוטומטי בתחילת כל אשכול AFIS.
בחר באפשרות עדשה אובייקטיבית למיקוד אוטומטי מהיר יותר ולהפחתת סחף שלבים. לחץ על הלחצן הכן את כל הריבועים במשימת בחירת החורים כדי להגדיר באופן אוטומטי את איסוף הנתונים ואת כל ריבועי הרשת האחרים שנבחרו בהתאם להגדרות המשמשות בריבוע הרשת הראשון הזה. בחר את משימת הגדרת התבנית, רכש תמונה חדשה, העבר את הבמה לאזור נקי בנייר כסף פחמן בלחיצה ימנית ובחר את שלב הזזת אפשרות התפריט כאן.
בחר בכרטיסייה פונקציות אוטומטיות. לאחר הגדרת ה-defocus והאיטרציה הרצויים, עבור אל ההגדרה המוגדרת מראש של המיקוד האוטומטי ולחץ על לחצן ההפעלה כדי להפעיל את פונקציית המיקוד האוטומטי. בחר את המשימה Autostigmate, עבור להגדרה מראש של Thon Ring ולחץ על לחצן התחל.
בחר את המשימה Autocoma ולחץ על לחצן התחל. הזזת שלב לאזור עם ריבוע רשת שבור. אשר את שקיפות האזור על-ידי צילום תמונת מיקוד אוטומטי אחת.
פתח את ממשק המשתמש של Sherpa ובחר את יישום מסנן האנרגיה. לחץ על לחצן מרכז ועל האפשרות אפס אובדן כדי למרכז את חריץ מסנן האנרגיה של אפס אובדן. לחץ על לחצן כוונון באפשרות איזוכרומטיות.
לחץ על האפשרות הגדלה של Tune ועיוותי Tune בעיוותים בעיוותים הגיאומטריים והכרומטיים. עבור אל הכרטיסיה EPU, בחר את משימת הרכש האוטומטי ולחץ על לחצן התחל הפעלה כדי להתחיל באיסוף נתונים אוטומטי לחלוטין. האיור מציג רשתות Cryo-EM המציגות שיפוע של עובי קרח על פני השטח של הרשת.
הרשתות שאינן נכללות בחקירה הנוספת הן רשת גרועה עם קרח עבה ורשת מכופפת עם קרח רע וזיהום, בעוד שרשתות מקובלות הן אלה עם שיפוע קרח טוב ורשת טיפוסית עם קרח דק טוב ושיפוע קרח קטן. האיור מציג את העיבוד התלת-ממדי הסופי של מפת האפופריטין Cryo-EM המשוחזרת. היציבות והסימטריה הגבוהות הופכות אותו לדוגמת אמת מידה אופטימלית להדמיית Cryo-EM ועיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה.
ליטוש בייסיאני, חידוד CTF ותיקון כדור אוואלד הובילו למפת רזולוציה של 1.63 אנגסטרום. האיור מציג תצוגה מפורטת של מפת האפופריטין Cryo-EM המשוחזרת ברמת שרשרת הצד של חומצות האמינו הבודדות. הצפיפות של שרשראות צד של חומצות אמינו נפתרת היטב וניתן לבנות את המודל האטומי באופן חד משמעי בתוך המפה.
התמונה כאן מציגה שני מערכי נתונים שונים בערכי defocus שונים שנאספו מאותה רשת Cryo-EM עם ריבועי רשת דומים עם חריץ פתוח לחלוטין וחריץ וולט של 10 אלקטרונים אשר מצביע על כך שחריץ 10 אלקטרון וולט משפר באופן משמעותי את ניגודיות התמונה. האיור כאן מציג סקירה כללית של מפת Cryo-EM הפרוטאזומית של 20S עם יחידות משנה מפולחות המשמשות כמדגם Cryo-EM סטנדרטי. והתצוגה המוגדלת שלו עם מודל אטומי מותאם מייצגת את הליבה הקטליטית היציבה של קומפלקס הפרוטאזומים עם הסימטריה D7.
הפרוטוקול מכיל שני שלבים קריטיים. האחת, מחפשת אזורים עם קרח זגוגי דק המכיל חלקיקים הומוגניים. ושתיים, הגדרת תאורה מקבילה לרכישת נתונים.
עם שחזורים ברזולוציה גבוהה של חלבונים שמשיגים שניים עד שלושה אנגסטרומים ברזולוציה, אתה מסוגל להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של מחלות ולשפר את מובילי התרופות. בעבר, התגבשות הייתה הכרחית אם אתה רוצה לחקור את הבסיס המבני של תופעות ביולוגיות. היום עם Cryo-EM, זה כבר לא הכרחי.
וכך, עם Cryo-EM, אנו מאפשרים למדענים לחקור מגוון רחב יותר של תופעות ביולוגיות ברמה המבנית.
